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1、,蛋白质存在于所有的生物细胞中，是构成生物体最基本的结构物质和功能物质。蛋白质是生命活动的物质基础，它参与了几乎所有的生命活动过程。,第二章 蛋白质(Protein),一、氨基酸二、肽三、蛋白质的分子结构四、蛋白质结构与功能的关系五、蛋白质的重要性质六、蛋白质的分类七、蛋白质的分离提纯及应用,概 述,一、蛋白质的定义 蛋白质：是一切生物体中普遍存在的，由天然氨基酸通过肽键连接而成的生物大分子；其种类繁多，各具有一定的相对分子质量，复杂的分子结构和特定的生物功能；是表达生物遗传性状的一类主要物质。二、蛋白质在生命中的重要性 早在1878年，思格斯就在反杜林论中指出：“生命是蛋白体的存在方式，这种
2、存在方式本质上就在于这些蛋白体的化学组成部分的不断的自我更新。”可以看出，第一，蛋白体是生命的物质基础；第二，生命是物质运动的特殊形式，是蛋白体的存在方式；第三，这种存在方式的本质就是蛋白体与其外部自然界不断的新陈代谢。现代生物化学的实践完全证实并发展了恩格斯的论断,1.蛋白质是生物体内必不可少的重要成分,蛋白质占干重 人体中（中年人）人体 45%水55%细菌 50%80%蛋白质19%真菌 14%52%脂肪19%酵母菌 14%50%糖类1%白地菌50%无机盐7%,2.蛋白质是一种生物功能的主要体现者,（1）酶的催化作用（2）结构组分（3）调节作用(多肽类激素)（4）运输功能（5）运动功能(6）
3、免疫保护作用(干扰素)（7）接受、传递信息的受体（8）参与基因表达的调控（10）贮藏功能（11）毒蛋白等,3.外源蛋白质有营养功能，可作为生产加工的对象.,三、蛋白质的组成,1.元素组成 蛋白质是一类含氮有机化合物，除含有碳、氢、氧外，还有氮和少量的硫。某些蛋白质还含有其他一些元素，主要是磷、铁、碘、锌和铜等。这些元素在蛋白质中的组成百分比约为：碳 50 氢 7 氧 23 氮 16%硫 03 其他 微 量,蛋白质中的氮占生物组织中所有含氮物质的绝大部分。因此，可以将生物组织的含氮量近似地看作蛋白质的含氮量。由于大多数蛋白质的含氮量接近于16%，所以，可以根据生物样品中的含氮量来计算蛋白质的大概
4、含量,蛋白质含量的测定：凯氏定氮法(测定氮的经典方法)优点：对原料无选择性，仪器简单，方法也简单；缺点：易将无机氮(如核酸中的氮)都归入蛋白质中,不精确。一般，样品含氮量平均在16%，取其倒数100/16=6.25，即为蛋白质换算系数，其含义是样品中每存在1g元素氮，就说明含有6.25g 蛋白质）；故：蛋白质含量=氮的量6.25,除了上法外，还有 紫外比色法 双缩脲法 Folin酚 考马斯亮兰G250比色法（条件：蛋白质必须是可溶的）,2.化学组成（两种类型）单纯蛋白质：水解为-氨基酸 结合蛋白质=单纯蛋白质+辅基,第一节 氨基酸化学,一、氨基酸的结构与分类,1.氨基酸的结构 氨基酸是蛋白质水
5、解的最终产物，是组成蛋白质的基本单位。从蛋白质水解物中分离出来的氨基酸有二十种，除脯氨酸外，这些天然氨基酸在结构上的共同特点为：,与羧基相邻的-碳原子上都有一个氨基，因而称为-氨基酸,COOHH2N CH-碳原子基团 R R基团,-氨基酸基本结构通式,-氨基酸的通式,2.生物体内的氨基酸类别,蛋白质氨基酸：蛋白质中常见的20种氨基酸 稀有的蛋白质氨基酸：蛋白质组成中，除上述20种常见氨基酸外，从少数蛋白质中还分离出一些稀有氨基酸，它们都是相应常见氨基酸的衍生物。如4-羟脯氨酸、5-羟赖氨酸等。非蛋白质氨基酸：生物体内呈游离或结合态的氨基酸。,构成蛋白质的20种氨基酸,二十种常见蛋白质氨基酸的分
6、类、结构及三字符号,据R基团化学结构分类,脂肪族A（中性、含羟基或巯基、酸性、碱性）,芳香族A(Phe、Tyr、Trp),杂环(His、Pro),据R基团极性分类,极性R基团AA,非极性R基团AA（种）,不带电荷（种）,带电荷：正电荷（种）负电荷（种）,据氨基、羧基数分类,一氨基一羧基,一氨基二羧基(Glu、Asp),二氨基一羧基(Lys、His、Arg),人的必需氨基酸LysTrpPheValMetLeuIleThrArg、His,非极性R基团氨基酸,不带电荷极性R基团氨基酸,带电荷R基团氨基酸,甘氨酸（Gly,G）,丙氨酸（Ala,A）,缬氨酸（Val,V）,亮氨酸（Lue,L）,异亮氨酸
7、（Ile,I）,中性脂肪族氨基酸,含羟基或硫脂肪族氨基酸,丝氨酸（Ser,S）,苏氨酸（Thr,T）,半胱氨酸（Cys,C）,甲硫氨酸（Met,M）,酸性氨基酸及酰胺,天冬氨酸（Asp,D）,谷氨酸（Glu,E）,天冬酰胺（Asn,N）,谷氨酰胺（Gln,Q）,碱性氨基酸,赖氨酸（Lys,K）,精氨酸（Arg,R）,杂环氨基酸,组氨酸（His,H）,脯氨酸（Pro,P）,芳香族氨基酸,苯丙氨酸（Phe,F）,酪氨酸（Tyr,Y）,色氨酸（Trg,W）,几种重要的不常见氨基酸在少数蛋白质中分离出一些不常见的氨基酸，通常称为不常见蛋白质氨基酸。这些氨基酸都是由相应的基本氨基酸衍生而来的。其中重要的
8、有4-羟基脯氨酸、5-羟基赖氨酸、N-甲基赖氨酸、和3,5-二碘酪氨酸等。这些不常见蛋白质氨基酸的结构如下,二.氨基酸的重要理化性质1.一般物理性质 常见氨基酸均为无色结晶,其形状因构型而异,溶解性：各种氨基酸在水中的溶解度差别很大，并能溶解于稀酸或稀碱中，但不能溶解于有机溶剂。通常酒精能把氨基酸从其溶液中沉淀析出。(2)熔点：氨基酸的熔点极高，一般在200以上。(3)味感：其味随不同氨基酸有所不同，有的无味、有的为甜、有的味苦，谷氨酸的单钠盐有鲜味，是味精的主要成分。旋光性：除甘氨酸外，氨基酸都具有旋光性，能使偏振光平面向左或向右旋转，左旋者通常用（-）表示，右旋者用（+）表示。(5)光吸收
9、：构成蛋白质的20种氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区(220nm)均有光吸收。在近紫外区(220-300nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。,2.氨基酸的离解性质氨基酸在结晶形态或在水溶液中，并不是以游离的羧基或氨基形式存在，而是离解成两性离子。在两性离子中，氨基是以质子化(-NH3+)形式存在，羧基是以离解状态(-COO-)存在。在不同的pH条件下，两性离子的状态也随之发生变化,PH 1 7 10净电荷+1 0-1 正离子 两性离子 负离子 等电点PI,3.氨基酸的等电点,当溶液浓度为某一pH值时，氨基酸分子中所含的-NH3+和-COO-数目正好相等，净电荷为0。这一
10、pH值即为氨基酸的等电点，简称pI。在等电点时，氨基酸既不向正极也不向负极移动，即氨基酸处于两性离子状态。侧链不含离解基团的中性氨基酸，其等电点是它的pK1和pK2的算术平均值：pI=(pK1+pK2)/2 同样，对于侧链含有可解离基团的氨基酸，其pI值也决定于两性离子两边的pK值的算术平均值。酸性氨基酸：pI=(pK1+pKR-COO-)/2 碱性氨基酸：pI=(pK2+pKR-NH2)/2,4 氨基酸光学性质,、除甘氨酸外，所有天然-氨基酸都有不对称碳原子，有L-型和D-型两种类型的光学异构体，自然界的氨基酸以L-型为主。所有天然氨基酸都具有旋光性。、参与蛋白质组成的20种氨基酸中色氨酸(
11、Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)的R基团中含有苯环共轭双键系统，在紫外光区（220-300nm）显示特征的吸收谱带，最大光吸收（max）分别为279、278、和259nm。由于大多数蛋白质都含有这些氨基酸残基，一般最大光吸收在280nm波长处，因此用紫外分光光度法可测定蛋白质含量。,酪氨酸的max275nm，苯丙氨酸的max257nm，色氨酸的max280nm，,氨基酸与水合茚三酮共热，发生氧化脱氨反应，生成NH3与酮酸。水合茚三酮变为还原型茚三酮。加热过程中酮酸裂解，放出CO2，自身变为少一个碳的醛。水合茚三酮变为还原型茚三酮。NH3与水合茚三酮及还原型茚三酮脱水缩合，生成蓝紫
12、色化合物。,5.氨基酸的化学性质,(1)与茚三酮的反应（颜色反应）,反应要点A.该反应由NH2与COOH共同参与B.茚三酮是强氧化剂C.该反应非常灵敏，可在570nm测定吸光值D.测定范围：0.550g/ml E.脯氨酸与茚三酮直接生成黄色物质（不释放NH3）应用：A.氨基酸定量分析（先用层析法分离）B.氨基酸自动分析仪：用阳离子交换树脂，将样品中的氨基酸分离，自动定性定量，记录结果。,反应特点A.为-NH2的反应B.在常温，中性条件，甲醛与-NH2很快反应，生成羟甲基衍生物，释放氢离子。应用：氨基酸定量分析甲醛滴定法（间接滴定）A.直接滴定，终点pH过高（12），没有适当指示剂。B.与甲醛反
13、应，滴定终点在9左右，可用酚酞作指示剂。C.释放一个氢离子，相当于一个氨基（摩尔比1：1）D.简单快速，一般用于测定蛋白质的水解速度。,(2)与甲醛反应,(3)与2,4-二硝基氟苯（DNFB）反应,反应特点A.为-NH2的反应B.氨基酸-NH2的一个H原子可被烃基取代(卤代烃)C.在弱碱性条件下，与DNFB发生芳环取代，生成二硝基苯氨基酸应用：鉴定多肽或蛋白质的N-末端氨基酸A.虽然多肽侧链上的-NH2、酚羟基也能与DNFB反应，但其生成物，容易与-DNP氨基酸区分和分离,首先由Sanger应用，确定了胰岛素的一级结构A.B.水解DNP-肽，得DNP-N端氨基酸及其他游离氨基酸C.分离DNP-
14、氨基酸D.由Edman于1950年首先提出为-NH2的反应用于N末端分析，又称Edman降解法,肽分子与DNFB反应，得DNP-肽,层析法定性DNP-氨基酸，得出N端氨基酸的种类、数目,(4)与异硫氰酸苯酯（PITC）的反应,Edman（苯异硫氰酸酯法）氨基酸顺序分析法实际上也是一种N-端分析法。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。,肽链（N端氨基酸）与PITC偶联，生成PTC-肽环化断裂：最靠近PTC基的肽键断裂，生成PTC-氨基酸和少 一残基的肽链，同时PTC-氨基酸环化生成PTH-氨基酸分离PTH-氨基酸层析法鉴定,Edman降解法的改进方法-DNS-
15、Edman降解法用DNS(二甲基萘磺酰氯)测定N端氨基酸原理DNFB法相同但水解后的DNS-氨基酸不需分离，可直接用电泳或层析法鉴定由于DNS有强烈荧光，灵敏度比DNFB法高100倍，比Edman法高几到十几倍可用于微量氨基酸的定量用Edman降解法提供逐次减少一个残基的肽链灵敏度提高，能连续测定。多肽顺序自动分析仪样品最低用量可在5pmol,（5）与荧光胺的反应-NH2的反应氨基酸定量,（6）与5,5-双硫基-双(2-硝基苯甲酸)反应-SH的反应测定细胞游离-SH的含量,（7）其他反应成盐、成酯、成肽、脱羧反应,第二节 肽,蛋白质是由一条或多条多肽(polypeptide)链以特殊方式结合而
16、成的生物大分子。蛋白质与多肽并无严格的界线，通常是将分子量在6000道尔顿以上的多肽称为蛋白质。蛋白质分子量变化范围很大,从大约6000到106道尔顿甚至更大,一.基本问题-肽 一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基之间失水形成的酰胺键称为肽键，所形成的化合物称为肽。由两个氨基酸组成的肽称为二肽，由多个氨基酸组成的肽则称为多肽。组成多肽的氨基酸单元称为氨基酸残基。,1.多肽,在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为氨基酸顺序通常在多肽链的一端含有一个游离的-氨基，称为氨基端或N-端；在另一端含有一个游离的-羧基，称为羧基端或C-端。氨基酸的顺序是从N-端的氨基酸残基开始，以C-端
17、氨基酸残基为终点的排列顺序。如上述五肽可表示为：Ser-Val-Tyr-Asp-Gln,2.肽键,肽键的特点是氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用。组成肽键的原子处于同一平面。肽键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转。在大多数情况下，以反式结构存在。,3 肽的化学性质 肽键中的亚氨基虽然不能解离，但肽链带有游离的N-端-NH2和C端-COOH，加上部分氨基酸可解离的R基团，因而与氨基酸一样具有两性解离的性质。肽的化学反应与氨基酸一样，游离的-氨基、-羧基、R基团可发生与氨基酸中相应基团类似的反应，如茚三酮三酮反应、sanger反应、Edman反应等。含有两个以上肽键的化合物在碱性溶
18、液中与Cu2+生成紫红色到蓝紫色的络合物，称为双缩脉反应，可用以测定多肽和蛋白质含量。,4.天然存在的重要多肽,在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚单位。但是，也有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在。这类多肽通常都具有特殊的生理功能，常称为活性肽。如：脑啡肽；激素类多肽；抗生素类多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。,肽类激素：如促甲状腺素释放激素（TRH）,谷胱甘肽(glutathione,GSH),谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的三肽谷氨酸的-羧基形成肽键SH为活性基团为酸性肽是体内重要的还原剂谷胱甘肽是某些氧化还原酶的辅酶，对巯基酶的-SH基有保护作用，且有防止过氧化物积累的功能,一种
19、抗菌素,+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO-+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO-Met-脑啡肽 Leu-脑啡肽 具有类似吗啡镇痛功能,第三节 蛋白质的分子结构,一.蛋白质的一级结构,1.蛋白质的一级结构(Primary structure)：即多肽链内氨基酸残基从N末端到c末端的排列顺序，或称氨基酸序列，是蛋白质最基本的结构。共价结构包括：(1)组成蛋白质的多肽链数目，(2)多肽链的氨基酸顺序，(3)多肽链内或链间二硫键的数目和位置。其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础。,2 一级结构测定,基本战略：片段重叠法氨基酸顺序直测法
20、要点：a.测定蛋白质的分子量及其氨基酸组分 b.测定肽键的N末端和C末端 c.应用两种或两种以上的肽键内切酶分别在多肽键的专一位点上断裂肽键；也可用溴化氰法专一性地断裂甲硫氨酸位点，从而得到一系列大小不等的肽段。d.分离提纯所产生的肽段，并分别测定它们的氨基酸顺序 e.将这些肽段的顺序进行跨切口重叠，进行比较分析，推断出蛋白质分子的全部氨基酸序列。,蛋白质顺序测定基本战略,A.样品必需纯（97%以上）；B.知道蛋白质的分子量；C.知道蛋白质由几个亚基组成；D.测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸的个数。E.测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。,测定蛋白质的一级结构的要求,二、蛋白
21、质的构象和维持构象的作用力,1 构型与构象 构型：立体异构体分子中取代原子或基团在空间的取向，如几何异构体和光学异构体。构型互变需要共价键的断裂。构象：取代基团当单键旋转时形成不同的立体结构这种空间位置的改变不涉及共价键的断裂。,2 维持蛋白质构象的作用力,蛋白质天然构象的稳定性主要是靠一系列弱作用力维持的，这些弱作用力主要有氢键、盐键、疏水作用、范德华力，此外还有共价二硫键、酯键和配位键。,1氢键 多发生在多肽链中负电性很强的氮原子或氧原子与NH或OH的氢原子之间。另一方面，水分子的氢原于和羟基基团也能和多肽链的有关原子或基团形成氢键，蛋白质表面的侧链通常倾向于形成这类氢键。2范德华力 一般
22、是指范德华吸引力。3疏水作用 疏水作用实际上不是疏水基团之间相互吸引，主要是介质水分子对疏水基团的推斥所致，或者说是由于疏水基团为了避开水分子而被迫靠近。4盐键 又称离子键，蛋白质分子中的某些氨基酸，其侧链是带电荷基团，它们之间可以形成离子键。5二硫键 多肽链内或不同链间的两个Cys残基的巯基，在氧化条件下形成二硫键。6配位键 两个原子之间由单方面提供共用电子对形成的共价键称为配位键。,维持蛋白质分子构象的作用力a.盐键 b.氢键 c.疏水键 d.范得华力 e.二硫键,多肽链,三.蛋白质的二级结构 蛋白质的二级(Secondary)结构是指蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，即该段肽链主链骨
23、架原子的相对空间位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象。,（1）肽单元(peptide unit),参与组成肽键的6个原子位于同一平面，又叫酰胺平面或肽键平面。它是蛋白质构象的基本结构单位。,肽单元,H,H,H,H,完全伸展的多肽主链构象,-碳原子,酰胺平面,=1800，=1800,=00，=00的多肽主链构象,酰胺平面,=00，=00,侧链,非键合原子接触半径,（2）蛋白质二级结构的主要形式,-螺旋(-helix)-折叠(-pleated sheet)-转角(-turn)无规卷曲(random coil),-螺旋,结构要点:多肽链主链围绕中心轴形成右(或左)手螺旋，侧链伸向螺旋外侧。每圈螺旋含3
24、.6个氨基酸，螺距为0.54nm。每个肽键的亚氨氢和第四个肽键的羰基氧形成的氢键保持螺旋稳定。氢键与螺旋长轴基本平行。,-折叠,多肽链充分伸展，相邻肽单元之间折叠成锯齿状结构，侧链位于锯齿结构的上下方。两段以上的-折叠结构平行排列，两链间可顺向平行，也可反向平行。两链间的肽键之间形成氢键，以稳固-折叠结构。氢键与螺旋长轴垂直。,-转角和无规卷曲,-转角：,无规卷曲：没有确定规律性的肽链结构。,肽链内形成180回折。含4个氨基酸残基，第一个氨基酸残基与第四个形成氢键。第二个氨基酸残基常为Pro。型-转角的第三个残基总是Gly,-转角：,无规则卷曲示意图,无规则卷曲,细胞色素C的三级结构,1超二级
25、结构和结构域（）超二级结构蛋白质中相邻的二级结构单位（即单个螺旋或折叠或转角）组合在一起，彼此相互作用，形成有规则的、在空间上能辩认的二级结构组合体称为蛋白质的超二级结构基本组合方式：；超二级结构在结构层次上高于二级结构，但没有聚集成具有功能的结构域,四、蛋白质的三级结构,（）结构域 在二级结构的基础上，多肽进一步卷曲折叠成几个相对独立、近似球形的三维实体，再由两个或两个以上这样的三维实体缔合成三级结构，这种相对独立的三维实体称为结构域。形成意义：动力学上更为合理 蛋白质（酶）活性部位往往位于结构域之间，使其更具柔性 结构域与功能域的关系：有时一个结构域就是蛋白质的功能域，但不总是包含一个但通
26、常是多个结构域,结构域,Triose phosphate isomerase,卵溶菌酶的三级结构中的两个结构域,-螺旋,-转角,-折叠,二硫键,结构域1,结构域2,2、蛋白质的三级结构,多肽键在二级结构的基础上，通过侧链基团的相互作用进一步卷曲折叠，借助次级键维系使螺旋、折叠片、转角等二级结构相互配置而形成特定的构象。三级结构的形成使肽链中所有的原子都达到空间上的重新排布。实例：肌红蛋白 核糖核酸酶,核糖核酸酶三级结构示意图,肌红蛋白(Mb),五、蛋白质的四级结构,四级结构是指由相同或不同的称作亚基（subunit）的亚单位按照一定排布方式聚合而成的蛋白质结构，维持四级结构稳定的作用力是疏水键
27、、离子键、氢键、范得华力。亚基本身都具有球状三级结构，一般只包含一条多肽链，也有的由二条或二条以上由二硫键连接的肽链组成。实例：血红蛋白 烟草花叶病毒的外壳蛋白四级结构,烟草花叶病毒外壳蛋白四级结构的自我组装,血红蛋白的四级结构,从一级结构到四级结构,血红蛋白,蛋白质的一级结构是它的氨基酸序列,蛋白质的二级结构是由氢键导致的肽链卷曲与折叠,Primarystructure,Secondarystructure,蛋白质的三级结构是多肽链自然形成的三维结构,蛋白质的四级结构是亚基的空间排列,Polypeptide(single subunitof transthyretin),Transthyre
28、tin,with fouridentical polypeptide subunits,Tertiarystructure,Quaternarystructure,维系蛋白质分子的一级结构：肽键、二硫键维系蛋白质分子的二级结构：氢键维系蛋白质分子的三级结构：疏水相互作用力、氢键、范德华力、盐键维系蛋白质分子的四级结构：范德华力、盐键,a盐键（离子键）b氢键 c疏水相互作用力 d 范德华力 e二硫键 f 酯键,氢键、范德华力、疏水相互作用力、盐键，均为次级键氢键、范德华力虽然键能小，但数量大疏水相互作用力对维持三级结构特别重要盐键数量小二硫键对稳定蛋白质构象很重要，二硫键越多，蛋白质分子构象越稳
29、定,离子键,氢键,范德华力,疏水相互作用力,第四节 蛋白质的分子结构与功能的关系,一、蛋白质一级结构与功能二、蛋白质高级构象与功能,蛋白质复杂的组成和结构是其多种多样生物学功能的基础；而蛋白质独特的性质和功能则是其结构的反映。蛋白质一级结构包含了其分子的所有信息，并决定其高级结构，高级结构和其功能密切相关。,一级结构决定高级结构，也决定蛋白质的功能,1、蛋白质一级结构的种属差异与同源性 实例：细胞色素2、蛋白质一级结构的变异与分子病 实例：血红蛋白质异常病变镰刀型贫血病3、蛋白质前体的激活与一级结构 实例：胰岛素原的激活,不同生物与人的Cytc的AA差异数目,生物 与人不同的AA数目黑猩猩 0
30、恒河猴 1兔 9袋鼠 10牛、猪、羊、狗 11马 12鸡、火鸡 13响尾蛇 14海龟 15金枪鱼 21角饺 23小蝇 25蛾 31小麦 35粗早链孢霉 43酵母 44,不同生物来源的细胞色素c中不变的AA残基,35个不变的AA残基，是Cyt C 的生物功能所不可缺少的。其中有的可能参加维持分子构象；有的可能参与电子传递；有的可能参与“识别”并结合细胞色素还原酶和氧化酶。,正常红细胞与镰刀形红细胞的扫描电镜图,镰刀形红细胞,正常红细胞,-链N端氨基酸排列顺序 1 2 3 4 5 6 7 8 Hb-A（正常人）Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys Hb-S（患 者）Val
31、-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys,这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，称为“分子病”。,猪胰岛素原激活成形成胰岛素示意图,高级构象决定蛋白质的功能,1、蛋白质高级构象破坏，功能丧失 实例：核糖核酸酶的变性与复性2、蛋白质在表现生物功能时，构象发生一定变化（变构效应）实例：血红蛋白的变构效应和输氧功能,核糖核酸酶变性与复性作用,Native ribonuclease,Denative reduced ribonuclease,Native ribonuclease,变性,复性,血红蛋白输氧功能和构象变化,疯牛病疯牛病是由朊病毒蛋白(prion protein,PrP)引
32、起的一组人和动物神经退行性病变。正常的PrP富含-螺旋，称为PrPc。PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为-折叠的PrPsc，从而致病。,PrPc-螺旋,PrPsc-折叠,正常,疯牛病,第五节 蛋白质的重要性质,一.蛋白质的分子大小蛋白质是分子量很大的生物分子，相对分子质量大于10 000.最高可达40 000 000（烟草花叶病毒）蛋白质相对分子质量的测定方法1.根据化学成分测定最小相对分子质量 此法首先利用化学分析方法测定蛋白质分子中某一特殊成分的百分含量，然后，假定蛋白质分子中该成分只有一个，据其百分含量可计算出最低相对分子质量：最小相对分子质量（已知成分的相对分子、原子质量）/
33、已知成分的百分含量 如果蛋白质分子中所含已知成分不是一个单位，则真实相对分子质量等于最小相对分子质量的倍数。,2.超离心法 在60 00080 000r/min的高速离心力作用下，蛋白质分子会沿旋转中心向外周方向移动，用光学方法测定界面移动的速度即为蛋白质的离心沉降速度，蛋白质的沉降速度与分子大小和形状有关。沉降系数是溶质颗粒在单位离心场中的沉降速度，用S表示。一个S单位，为110-13秒 相对分子质量越大，S值越大 蛋白质的沉降系数：1200S 由沉降系数S可根据斯维得贝格Svedberg方程计算蛋白质分子的相对分子质量：M=RST/D1i R：气体常数 T：绝对温度 D：扩散系数：溶剂的密
34、度,3.凝胶过滤法 凝胶过滤所用介质为凝胶珠，其内部为多孔网状结构一定型号的凝胶网孔大小一定，只允许相应大小的分子进入凝胶颗粒内部，大分子则被排阻在外。洗脱时大分子随洗脱液从颗粒间隙流下来，洗脱液体积小；小分子在颗粒网状结构中穿来穿去，历程长，后洗脱下来，洗脱体积大。测定蛋白质分子量一般用葡聚糖，商品名：Sephadex 测得几种标准蛋白质的洗脱体积Ve 以相对分子质量对数（logM）对Ve作图，得标准曲线 再测出未知样品洗脱体积Ve 从标准曲线上可查出样品蛋白质的相对分子质量,4.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法SDS:十二烷基硫酸钠，变性剂普通蛋白质电泳的泳动速率取决于荷质比（净电荷、大小、形
35、状）。用SDS和巯基乙醇（打开二硫键）处理，蛋白质变性（肽链伸展）并与SDS结合，形成SDS-蛋白质复合物；不同蛋白质分子的均带负电（SDS带负电）；且荷质比相同（蛋白质分子大，结合SDS多；分子小，结合SDS少）；不同蛋白质分子具有相似的构象用几种标准蛋白质相对分子质量的对数值对它们的迁移率作图；测出待测样品的迁移率从标准曲线上查出样品的相对分子质量,影响迁移率的主要因素凝胶的分子筛效应对长短不同的棒形分子会 产 生不同的阻力主要因素凝胶的浓度和交联度同一电泳条件下，分子小，受阻小，游动快，迁移率大。相对分子质量大者，迁移率小 优点：快速，样品用量少，可同时测几个样品 缺点：误差大，约为10
36、（误差主要来源于迁移距离的测量误差）此方法只能测得 亚基肽链的相对分子质量,（一）蛋白质的两性电离,蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。,二.蛋白质的两性解离和电泳现象,蛋白质的等电点(isoelectric point,pI)当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。,利用蛋白质两性电离的性质，可通过电泳、离子交换层析、等电聚焦等技术分离蛋白质。,蛋白质在等电点pH条件下，不发生电泳现象。利用蛋白质的电泳现象，可以将蛋白质进行分
37、离纯化。,蛋白质在溶液中解离成带电颗粒，在电场中可以向电荷相反的电极移动，这种现象称为电泳。,（二）蛋白质的胶体性质,蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万至100万之巨，其分子的直径可达1100nm，为胶粒范围之内。,*蛋白质胶体稳定的因素颗粒表面电荷水化膜,由于蛋白质的分子量很大，它在水中能够形成胶体溶液。蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质，如丁达尔现象、布郎运动等。由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。,水化膜,溶液中蛋白质的聚沉,（三）蛋白质的变性、沉淀和凝固,*蛋白质的变性(denaturation)在某些物理和化学因素作用下，蛋白质分子的
38、特定空间构象被破坏，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失。,造成变性的因素：如加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂等。,应用举例临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。,蛋白质变性后的性质改变：溶解度降低、粘度增加、结晶能力消失、生物活性丧失及易受蛋白酶水解。,若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性。,复性(renaturation),天然状态，有催化活性,尿素、-巯基乙醇,去除尿素、-巯基乙醇,非折叠状态，无活性,*蛋白质沉淀在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在
39、外，肽链融会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。,*蛋白质的凝固作用(protein coagulation)蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。,1.可逆沉淀(1)在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。(2)在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。(3)可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。2.不可逆沉淀(1)在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳
40、定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。(2)由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。(3)如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。,（四）.蛋白质的紫外吸收 大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。这三种氨基酸的在280nm 附近有最大吸收。因此，大多数蛋白质在280nm 附近显示强的吸收。利用这个性质，可以对蛋白质进行定性鉴定。,测定范围：0.10.5mg/ml,(五)蛋白质主要呈色反应,双缩脲反应 酚试剂反应 蛋白质定量、定性 茚三酮反应 测定常用方法,1.双缩脲反应：两分子双缩脲与碱性
41、硫酸铜作用，生成红色的复合物。含有两个或两个以上肽键的化合物，能发生同样的反应。肽键的反应，肽键越多颜色越深。受蛋白质特异性影响小。蛋白质定量测定；测定蛋白质水解程度。,2.米伦氏反应酪氨酸的显色反应（酚羟基反应）米伦试剂为硝酸、亚硝酸、硝酸汞、亚硝酸汞的混合物蛋白溶液中，加入米伦试剂，产生白色沉淀，加热后变成红色3.乙醛酸反应在蛋白质溶液中加入HCOCOOH，将浓硫酸沿管壁缓慢加入，不使相混，在液面交界处，即有紫色环形成色氨酸的反应（吲哚环的反应）鉴定蛋白质中是否含有色氨酸明胶中不含色氨酸,4.坂口反应精氨酸的反应（胍基的反应）精氨酸与-萘酚在碱性次氯酸钠（或次溴酸钠）溶液中发生反应，产生红
42、色产物鉴定蛋白质中是否含有精氨酸定量测定精氨酸5.福林试剂反应酪氨酸、色氨酸的反应（还原反应）福林试剂：磷钼酸-磷钨酸 与双缩脲法结合-Lowry法在碱性条件下，蛋白质与硫酸铜发生反应蛋白质-铜络合物，将福林试剂还原，产生磷钼蓝和磷钨蓝混合物灵敏度提高100倍,6.茚三酮反应灵敏度差7.黄蛋白反应浓硝酸与酪氨酸、色氨酸的反应生成黄色化合物指甲、皮肤、毛发8.考马斯亮蓝G-250本身为红色，与蛋白质反应呈蓝色与蛋白的亲和力强，灵敏度高1-1000微克/毫升,第六节 蛋白质的分类,一.依据蛋白质的外形分类 按照蛋白质的外形可分为球状蛋白质和纤维状蛋白质。1.球状蛋白质（globular prote
43、in）：外形接近球形或椭圆形，溶解性较好，能形成结晶，大多数蛋白质属于这一类。2.纤维状蛋白质(fibrous protein)：分子类似纤维或细棒。它又可分为可溶性纤维状蛋白质和不溶性纤维状蛋白质。如胶原、角蛋白、丝蛋白等。,二.依据蛋白质的组成分类 按照蛋白质的组成，可以分为1.简单蛋白(simple protein)：又称为单纯蛋白质；这类蛋白质只含由-氨基酸组成的肽链，不含其它成分。（1）清蛋白和球蛋白：albumin and globulin广泛存在于动物组织中。清蛋白易溶于水，球蛋白微溶于水，易溶于稀酸中。（2）谷蛋白(glutelin)和醇溶谷蛋白(prolamin)：植物蛋白，
44、不溶于水，易溶于稀酸、稀碱中，后者可溶于7080乙醇中。（3）精蛋白和组蛋白：碱性蛋白质，存在与细胞核中。（4）硬蛋白：存在于各种软骨、腱、毛、发、丝等组织中，分为角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白和丝蛋白。,2.结合蛋白(conjugated protein)：由简单蛋白与其它非蛋白成分结合而成（1）色蛋白：由简单蛋白与色素物质结合而成。如血红蛋白、叶绿蛋白和细胞色素等。（2）糖蛋白：由简单蛋白与糖类物质组成。如细胞膜中的糖蛋白等。（3）脂蛋白：由简单蛋白与脂类结合而成。如血清-，-脂蛋白等。（4）核蛋白：由简单蛋白与核酸结合而成。如细胞核中的核糖核蛋白等。（5）金属蛋白：由简单蛋白与金属离子的结合
45、物。如铁硫蛋白、铁氧还蛋白、细胞色素类等含铁、铜、锌、钼的蛋白，肌浆钙蛋白、嗜热菌蛋白酶等。（6）磷蛋白：由简单蛋白质和磷酸组成。如胃蛋白酶、酪蛋白、角蛋白、弹性蛋白、丝心蛋白等。,一、蛋白质分离纯化的一般原则 1、前处理 2、粗分级：通常用盐析、等电点沉淀、超滤、有机溶剂分级等简便、处理量大的方法从蛋白质混合液中除去大量杂质，得到浓缩蛋白质溶液。3、细分级：选用分辨率高的方法进一步提纯，如经过凝胶过滤、吸附层析、离子交换层析、反相高效液相层析、亲和层析以及凝胶电泳、等电聚焦等。,第七节 蛋白质的分离和纯化,（一）透析及超滤法,*透析(dialysis)：利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物
46、分开的方法。,*超滤法：应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。,（二）丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀,*使用丙酮沉淀时，必须在04低温下进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。,*盐析(salt precipitation)是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。,*免疫沉淀法：将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。,（三）
47、电泳,蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术,称为电泳(elctrophoresis)。根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳等。,几种重要的蛋白质电泳*SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：常用于蛋白质分子量的测定。*等电聚焦电泳：通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。*双向凝胶电泳：是蛋白质组学研究的重要技术。,（四）层析,层析(chromatography)分离蛋白质的原理待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组
48、分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的。,蛋白质分离常用的层析方法*离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。*凝胶过滤(gel filtration)又称分子筛层析：利用各蛋白质分子大小不同分离。,（五）超速离心,*超速离心法(ultracentrifugation)既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。,*蛋白质在离心场中的行为用沉降系数(sedimentation coefficient,S)表示,沉降系数与蛋白质的密度和形状相关。,二、蛋白质的应用,疾病的预防、治疗和辅助诊断：疫苗、胰岛素、生长激素、丙种球蛋白、蛋白酶制剂、抗体等食
49、品加工和饲料工业：淀粉酶、果胶酶、纤维素酶、碱性蛋白酶等。,本章小节,蛋白质的组成（元素组成、化学组成）及蛋白质含量的测定蛋白质的生物学作用：功能蛋白、结构蛋白二十种氨基酸的结构、分类及名称（三字缩写符、单字缩写符）氨基酸的重要理化性质：两性解离、茚三酮显色、与2,4-二硝基氟苯（DNFB）反应、与异硫氰酸苯酯（PITC）的反应蛋白质的一级结构：肽、肽键、活性多肽及一级结构的测定蛋白质的空间结构：二级结构单元（-螺旋、-折叠、-转角、自由回转）、三级与四级结构（超二级结构、结构域、亚基）及结构与功能的关系蛋白质的性质：大分子性质、蛋白质分子量的测定（离心法、凝胶过滤法、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电
50、泳法）、两性解离（等电点、电泳、离子交换）、胶体性质、蛋白质沉淀（可逆沉淀、不可逆沉淀）、蛋白质变性、紫外吸收及颜色反应蛋白质的分类：按外形及组成分类,习 题,1、为什麽说蛋白质是生命活动最重要的物质基础？2、试比较Gly、Pro与其它常见氨基酸结构的异同，它们对多肽链二级结构的形成有何影响？3、试举例说明蛋白质结构与功能的关系（包括一级结构、高级结构与功能的关系）。4、为什么说蛋白质水溶液是一种稳定的亲水胶体？5、什麽是蛋白质的变性？变性的机制是什麽？举例说明蛋白质变性在实践中的应用。名词解释等电点（pI）肽键和肽链 肽平面及二面角 一级结构 二级结构 三级结构 四级结构 超二级结构 结构域
