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1、PCR技术及其应用,生物化学实验技术,农业生物学实验教学中心,制作人：张杰道,目 录,PCR的反应原理PCR的类型和应用PCR示例,多聚酶链式反应（PCR：Polymerase Chain Reaction),Kary B.Mullis,PCR是由美国科学家穆利斯提出的一种体外简化条件下模拟DNA体内复制的DNA快速扩增的方法，此技术获得1993年诺贝尔化学奖。,体内DNA的复制体系,DNA聚合酶（I II III）,拓扑异构酶解旋酶类SSB,引物dNTP Mg2+,Mullis的PCR构思,Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus),酶活性(%),温度(),40 50 60
2、70 80 90 100,100 80 60 40 20,耐热DNA聚合酶,Saiki（1988）将耐热DNA聚合酶引入PCR，使利用热变性解链DNA模板可行。,PCR反应循环,Taq,P1,P2,PCR反应体系,dATP,dTTP,dGTP,dCTP,Mg2+,模板：DNA引物：P1 P2DNA聚合酶：Taq原料：dNTP反应缓冲液辅助因子：Mg2+,1）PCR反应成分,（1）模板 单、双链DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。DNA模板一般100ng/100L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。,PCR反应条件,（2）引物浓度 0.1-0.5 mol
3、/L 浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。（3）Taq DNA聚合酶 0.5-2.5 U/50 l 酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。,（4）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。,（5）Mg2+,Mg2+是DNAmmol/L反应体系。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。,2
4、）循环参数变性 使双链DNA解链为单链 94，20-30秒(2)退火 温度由引物长度和GC含量决定。增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。,（3）延伸 70-75,一般为72 延伸时间由扩增片段长度决定（4）循环次数 主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加,PCR技术的特点,1）高度的灵敏性,30轮循环,扩增量达230个拷贝（109拷贝）,PCR产物每轮循环增加一倍,2）特异性,引物,引物,引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反 应结果的关键。引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和 特异性；同时尽可能减
5、少非特异性扩增。,引物设计：（1)序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源 序列。（2）引物长度以15-40 bp为宜。（3）碱基尽可能随机分布,G+C占40-60%。（4）引物内部避免形成二级结构。（5）两引物间避免有互补序列。（6）引物3端为关键碱基；5端无严格限制。,3）操作简便易行,利用PCR扩增,只需要数小时,就可以扩增出 可用电泳法检出的DNA，可用于检测基因组中仅含数个拷贝的模板序列。,1）不对称PCR 目的：扩增产生特异长度的单链DNA。方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.010.5M,关键是限制性引物的绝对量。用途：制备核酸序列测
6、定的模板；制备杂交探针；基因组DNA结构功能的研究,PCR的类型,高浓度引物,低浓度引物,2)反向PCR(reverse PCR),用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段，对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。,未知序列,未知序列,已知序列,已知序列,未知序列,未知序列,限制酶,限制酶,连接酶,3）多重PCR（复合PCR）,用于检测特定基因序列的存在或缺失。,电泳,引物,1,2,3,4,1,2,3,4,4）LP-PCR（Labelled primers),利用同位素、荧光素等对引物进行标记,用以直观地检测目的基因。特别适合大量临床标本的基因诊断 可同时检测多种基因成分,标记引物,观
7、察,PCR产物,5）锚定PCR（anchored PCR,A-PCR）,锚定PCR首先合成第一链cDNA,然后再添加一同聚物尾（polydG),与同聚物尾配对的3锚定引物（带有限制性内切位点polydC)一起作PCR扩增,cDNA,末端核酸转移酶,3GGGG,5,CCCC 锚定引物,3GGGG,5,CCCC,3GGGG,CCCC,6）PCR固相分析法,检测探针信号,可用于基因芯片的制作,7）原位,原位聚合酶链式反应（In Still PCR,IsPCR）是由Haase等于1990年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段,在不破坏细胞的前提下,利用一些特定的检测手段
8、来检测细胞内的扩增产物。直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行扩增。可进行细胞内定位和检测病理切片中含量较少的靶序列。,操作步骤1.细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理后便适于一般PCR试剂（包括引物和Taq酶）进入2.PCR扩增细胞内目的片段3.原位杂交检测扩增产物,A.阳性对照,B.阴性对照,C.原位检测mRNA表达,8）,逆转录酶,聚合酶,mRNA,cDNA,杂化双链,PCR扩增,9)荧光定量 PCR（real-time PCR)通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标 记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板
9、量。,内掺式染料SYBR Green I序列特异性探针Taqman Molecular Beacons Dual Probes(FRET)引物特异性探针 Amplifluor(Intergen),SYBR-Green I,实时荧光定量PCR仪,梯度PCR仪,普通PCR仪,PCR示例,一、实验目的,学习PCR分析的原理与技术。,1、材料：含1Kb插入片段的克隆载体Pmd18-T 质粒DNA2、仪器：微量移液器及吸头、PCR仪及PCR管 琼脂糖凝胶电泳设备3、试剂：10XPCR反应缓冲液 25mmol/L MgCl2 10mmol/L dNTP 10mol/L 引物1和引物2,二、实验材料、仪器和
10、试剂,1.按照如下体积向PCR管中按顺序加入各试剂 并混匀：10 X PCR反应缓冲液 2.5 L 25mmol/L MgCl2 2.0L 10mmol/L dNTP 1.0 L 10mol/L 引物1 1.0 L 10mol/L引物2 1.0L 质粒DNA 1.0 L Taq 0.1 L(5U)水补充至 25.0 L,三、操作步骤,2.按照如下体积向PCR管中按顺序加入各试剂 并混匀：10 X PCR反应缓冲液 2.5 L 25mmol/L MgCl2 2.0L 10mmol/L dNTP 1.0 L 10mol/L 引物1 1.0 L 10mol/L引物2 1.0L 质粒DNA 1.0 L Taq 0.1 L(5U)水补充至 25.0 L,三、操作步骤,3.反应完成后,将反应液与凝胶电泳缓冲液按比例混匀,上样电泳。,三、操作步骤,The End！,
