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1、第十章 有机高分子基质的高效液相色谱分离柱填料,首先回顾几个问题,HPLC方法的主要特点有那些？HPLC的主要设备分哪几部分？,HPLC方法的主要特点,分离效率高，选择性好，适于各种多元组分复杂化合物的分离应用范围广：无机物有机物，天然物质合成产物，小分子-大分子，一般化合物到生物活性物质分离机理各异，色谱柱、淋洗体系和操作参数选择广泛分离纯化+分析检测样品量从痕量到大规模制备，实现在线监测和自动化操作。,HPLC的关键设备,专用的高压输液系统;高灵敏检测系统;高效分离柱其中分离柱是色谱的中心,是最为关键的部分,与经典色谱的比较,HPLC分离填料：,有机基质,多糖型凝胶,高聚物树脂,无机基质,
2、硅胶,氧化锆,氧化铝,多孔玻璃,羟基磷灰石,石墨化碳黑,基质微球天然多糖或合成单体或交联剂负载样品的能力强，色谱容量高耐酸碱、具化学稳定性，柱寿命长，易再生不易产生非特异性吸附作用,一、HPLC色谱柱的关键在于填料,物理结构色谱动力学（粒度与粒度分布、孔径与孔径分布、颗粒强度和表观形态柱效率、穿透性）化学结构色谱热力学（连接在基质上的官能团或链段样品保留值、选择性）,1、HPLC色谱柱填料在物理结构上的要求:颗粒大小合适，粒度分布较窄;颗粒强度适应高速高压操作;多孔型的孔径大小和孔径分布适宜,避免复杂的微孔结构;一定的溶胀及收缩水平。,常见的液相色谱填料类型,目前的主要发展方向(研究热点):颗
3、粒单分散的填料;贯穿性超大孔结构的填料;小颗粒的非多孔填料。,2、HPLC色谱柱填料在化学结构上的要求特定的选择性;良好的化学稳定性及热稳定性;避免不可逆吸附。不同填料的化学结构是通过对基质材料的化学改性而实现的。,离子交换色谱填料 颗粒表面携带季铵基、DEAE基、磺酸基、羧基等强弱阴阳离子集团。反相色谱填料 C18、C8烷基等疏水性集团正相色谱填料 羟基、氨基、氰基等弱疏水性集团亲和色谱填料 蛋白质、抗体、激素、抗菌素、酶等具有生物特异性的配基,二、有机高分子类型的HPLC填料基质树脂,基质材料决定填料物理结构和化学结构:颗粒大小与分布,颗粒强度,孔径大小,孔结构形态,颗粒内部的化学结构及其
4、稳定性,直接影响对颗粒的表面(包括内孔表面)的化学修饰。可分为:多糖型聚合物型,（一）多糖型基质材料,1.葡聚糖系:高交联的羟丙基化葡聚糖,其颗粒刚性好,粒度小而且分布范围窄（1023m）;Sephasorb HP Uitrafine 用于中低压色谱和高效色谱烯丙基葡聚糖与N,N-亚甲基双丙烯酰胺交联共聚而成的凝胶。Sephacryl系列(S-100HR,S-200HR,S-300HR)属于高效凝胶，较高流速下使用,2.琼脂糖系:Sepharose与2,3-二溴丙醇反应生成琼脂糖凝胶 Sepharose CL(CL-2B,CL-4B,CL-6B)高度偶联琼脂糖凝胶Sepharose Fast
5、Flow(Sepharose 6FF,Sepharose 4FF)高效琼脂糖凝胶Sepharose high PerformanceSuperdax(葡聚糖与交联琼脂糖的结合)：快流速Superose(珠状琼脂糖经两次交联)：高效凝胶,（二）聚合物型基质材料,交联聚苯乙烯树脂:苯乙烯与二乙烯苯的交联共聚物(PS-DVB)，是应用最为广泛的一类基质树脂。交联聚甲基丙烯酸酯类树脂:以甲基丙烯酸的甲脂、丁酯、羟基乙酯、环氧丙酯等化合物为单体制备的交联高聚物。,三、填料性能评价,填料的物化性质指标填料的色谱性能表征,1、物化性质指标:a.颗粒大小及其分布(dp);b.比表面积S(m2/g)；c.骨架密
6、度g(g/ml)、溶剂吸收量Sr(ml/g)、溶胀因子f;d.比孔体积Vp(ml/g);e.孔度；f.孔径大小及分布；g.化学结构与化学性质。,2、色谱性能表征:保留值：保留时间(TR),保留体积(VR),容量因子(K)选择性：相邻二物质保留时间之比,与固定相、流动相及温度有关。柱效率：理论塔板数(N)，或理论塔板高度(H)表示。填充柱的总空隙度和穿透性：分离度(R)：相邻两色谱峰的保留值之差与各自峰底宽度一半之和的比值。,四、反相HPLC高分子填料Reversed Phase Chromatography,RPC,反相色谱（原理参照P237）：非极性固定相，极性流动相，强极性组分先洗脱出来。
7、,1.目前RPC分离柱以硅胶基质的键合相填料为主，特别是键合C18，C8烷基以及苯基填料。特点：传质快，刚性好，柱效高，选择性好。不足：pH28，容易使蛋白质失活（残留的硅羟基）,广泛使用的是微球形交联聚苯乙烯树脂，另有带C18烷基侧链的聚丙酰胺、聚甲基丙烯酸的烷基酯化物、聚乙烯醇的酯化物，C18烷基键合的聚乙烯醇。优点：pH范围较广，表面有较强的疏水性,主要厂家,日本：东洋-曹达Tosoh-TSK瑞士：Hamilton,汉密尔顿,英国：高聚物实验室Polymer Lab美国：Bio-Rad伯乐瑞典：安捷伦Agilent详见：P194表101,被分离样品的分子量大小与填料的孔径选择 如PLRP
8、S填料：孔径10nm，适于分离1520个氨基酸长度的肽类；孔径30nm，适于分离中等分子量的球形蛋白质；孔径100nm，适于分离较大的球形蛋白质或纤维状结构的化合物；孔径400nm，适于分离很大分子量的蛋白质。,三氟乙酸(TFA),在IEC中,高分子类型填料表现更大的优越性。大致有3类：多糖基质的离子交换层析介质聚合物基质的高效离子交换色谱填料高聚物型离子交换色谱填料,五、离子交换HPLC填料Ion exchange chromatography IEC,1.多糖基质的离子交换层析介质传统的多糖类软质凝胶制得强弱阴阳离子交换介质：具有很好亲水性和生物相容性；高交联度多糖类凝胶填料：还适于较高压
9、力和流速下操作。,2.聚合物基质的高效离子交换色谱填料交联共聚的苯乙烯-二乙烯苯聚甲基丙烯酸酯;4-乙烯吡啶共聚物特点：高交联大孔结构,良好的刚性 和小而均匀的粒度,a.多孔树脂的IEC填料:柱效、穿透性、分离度、负载量、回收率的性能优异Mono Beads 系列：包括Mono Q,Mono S,Mono PSOURCE系列:15Q,15S,30Q,30S贯流色谱填料POROS系列羟基化聚醚凝胶：如TSK gel DEAE-5PW,SP-5PW,CM-5PW等交联聚甲基丙烯酸羟基乙酯:亲水,大孔,b.非多孔树脂的IEC填料:羟基化聚醚,交联聚苯乙烯,交联聚甲基丙烯酸酯,交联琼脂糖等。优点:颗粒
10、小,均匀,刚性好,色谱穿透性强,流速适应范围宽。避免了固相内的吸附与扩散，因此具有高柱效,高分离度和高样品回收率的特点。,c.薄壳型树脂的IEC填料:优点:柱效高,选择性好,分离度高,穿透性好,回收高,流速快等,有机高分子类型的疏水HPLC填料Hydrophobic interaction chromatography,HIC,HIC:填料表面具有弱疏水性,蛋白质的疏水基团与填料表面之间产生弱的疏水性相互作用。高浓度盐条件下,蛋白质与疏水固定相的吸附能力高,随着盐浓度的下降,吸附能力下降。当淋洗液离子强度逐渐降低时,蛋白质样品按其疏水性的不同依次被洗脱。,常见淋洗液有(NH4)2SO4,NH4
11、Ac,NaCl,磷酸盐等,其中(NH4)2SO4是最广泛应用的。与RPC比较在原理上的区别及其优缺点?,六、疏水色谱HPLC填料,一般是亲水性基质,或在合成的非亲水性基质上连接一定的亲水基团，然后引入疏水性基团,主要有丁基、辛基、苯基等以及聚乙二醇。其基质可以是多糖类,也可以是各类高分子多聚物,包括交联聚苯乙烯树脂、硅胶、羟基化聚醚树脂、交联甲基丙烯酸酯类。HIC填料绝大多数是多孔结构,主要是超大孔结构，也可以是非多孔结构的。P206表10-4,七、有机高分子类型的空间排阻HPLC填料Size exclusion chromatography,SEC,SEC填料特征：填料的性质必须与溶质和淋洗
12、体系相匹配,可以被淋洗剂所浸润；填料和试样尽可能不发生任何基团之间的相互作用,即尽可能避免非空间排阻效应；填料的多孔结构是SEC建立的基础；,SEC填料的色谱特征：除了柱效,选择性,分离度,穿透性等一般色谱表征外,尚需要满足以下指标：排阻极限;分离范围;固流相比,凝胶填料主要类型,多糖类传统的软质凝胶:葡聚糖,琼脂糖,聚丙烯酰胺型凝胶高交联的多糖类凝胶:Superdex,Superose,Sephacryl,Sepharose CL高聚物型多孔交联聚甲基丙烯酸酯类树脂,交联聚乙烯醇树脂,亲水化处理的交联聚苯乙烯树脂,羟基化聚醚类.(表10-7 P213),凝胶渗透色谱Gel permeation chromatography,GPC,有机溶济为流动相THF四氢呋喃,有机高分子类型生物亲和HPLC填料Affinity chromatography,AFC,优点:高选择性,能有效保持生物分子的高级结构稳定性,活性样品的回收率。按其基质不同分:多糖型和高聚物型。按其所带配体对被分离物质的选择性特征可分为通用型和专用型。,
