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1、第五章,动物细胞制药,第一节 概述,1665年英国物理学家虎克用自制的显微镜发现了细胞，实际上是死细胞留下的细胞壁，不久，荷兰科学家列文虎克才真正观察到了细胞。从此认为细胞是一切动植物体结构和功能的基本单元。1838年德国的植物学家施莱登和动物学家施旺共同创立了细胞学说。,细胞学说,所有生物都是由一个或多个细胞组成的；细胞是生命的基本单位；新细胞是由原有细胞分裂而来的。,细胞培养是将细胞从机体取出，在体外模拟机体体内生理条件进行培养，使之生存和生长。细胞培养已有近百年历史了。随着细胞生物学、分子生物学、生物化学和基因工程等一系列学科和技术的发展，逐渐形成了细胞工程学。,细胞工程是以细胞为单位，
2、按人们的意志，应用生物学、分子生物学等理论和技术，有目的地进行精心操作，使细胞的某些遗传特性发生改变，从而达到改良或产生新品种的目的，以及使细胞增加或重新获得产生某种特定产物的能力，从而在离体条件下进行大量培养、增殖，并提取出对人类有用的产品。,第二节 动物细胞的形态和生理特点,一、动物细胞的形态动物细胞属于真核细胞，结构复杂，分化精确，不同细胞执行不同的功能，例如神经细胞具有很长的分支，很多的纤维，以便接受和传递刺激，红细胞呈扁圆盘状，增大其接触面等。但细胞在离体培养时形态会发生变化，根据不同的需要将离体培养的细胞分为三类：贴壁依赖型、贴壁非依赖型和兼性贴壁型。,1、贴壁细胞,生长时必须要有
3、给以贴附的支持物表面，细胞依靠自身分泌的或培养基中提供的贴附因子才能在该表面上生长和繁殖。,细胞在表面上生长时有两种形态，成纤维样细胞型和上皮样细胞型。成纤维样细胞型主要来源于中胚层组织细胞，如心肌细胞、平滑肌细胞成骨细胞等。上皮样细胞型主要来源于外胚层和内胚层组织细胞，如皮肤细胞、肠管上皮细胞，在培养过程中，随着培养条件的变化细胞形态也会发生改变。,贴壁细胞单层培养的优点,1、可以很方便地进行完全换液；2、如果需要高细胞密度，可通过灌流技术完成；3、很多细胞只有在贴壁时才能更有效地表达产物；4、可用于所有细胞类型。,细胞贴壁的表面处理可以使用三种物质,1、玻璃，重复使用贴壁效果会降低，用1m
4、mol/L醋酸镁室温浸泡几个小时，再用蒸馏水反复冲洗可恢复贴壁能力。2、塑料，聚苯乙烯最常用。3、金属，不锈钢或钛，化学特性呈惰性，具有适合的高阴性电量。,单层培养的放大,1、转瓶；2、改进的转瓶，玻璃管、增大表面积的转瓶；3、单元操作系统，玻璃珠反应器、微载体系统。,2、悬浮细胞生长不依赖支持物表面，在培养液中悬浮生长，如淋巴细胞等。3、兼性贴壁细胞根据生长条件的不同可贴壁也可悬浮生长，中国地鼠卵巢细胞。,二、动物细胞生理特点,1、分裂期长 12-48小时，同一种属不同部位的细胞也不相同，分裂期受培养条件的影响如温度、酸度、成分等。,2、细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象。大多数二倍体细
5、胞的生长都需在一定的基质上贴附，伸展后才能生长繁殖，机制并不清楚，当细胞在基质上分裂增殖，逐渐汇合成片时，即细胞与周围细胞接触时，细胞就停止增殖接触抑制，若细胞转化成异倍体后，该抑制可解除。,3、正常二倍体细胞的寿命是有限的。正常二倍体细胞传代培养都是有限的，大约在50代左右，然后细胞就会逐渐死亡，但在培养基中加入表皮生长因子或经自然和人为的因素转为异倍体后该细胞可转变成无限细胞系，更适合于工业生产。,4、动物细胞对周围环境十分敏感 物理化学因素，如渗透压、酸度、离子浓度、剪切力、微量元素等的变化都会影响其生长，这是由于动物细胞没有细胞壁的保护，所以更敏感。,5、动物细胞对培养基要求很高 原核
6、生物只要有碳源、氮源和无机盐就可以生长；而动物细胞不仅需要12种必需氨基酸、8种以上维生素，多种无机盐和微量元素、葡萄糖外，还需要多种细胞生长因子和贴壁因子。,6、动物细胞蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同。动物细胞蛋白质的合成在游离和粗面型内质网上都可以进行，内质网上合成的蛋白质多数为糖蛋白，需要糖基化，而细菌细胞则没有糖基化过程。,动物细胞作为宿主细胞生产药物的优点和缺点：,优点：多半可分泌到细胞外，提取纯化方便，蛋白质经糖基化修饰后与天然产物更一致，适合于临床应用。缺点：培养条件要求高、成本高、产量低。,第三节 生产用动物细胞的要求和获得,一、要求最初要求生产用动物细胞必须是原代细胞，
7、以后放宽至二倍体细胞即可，即使是经过多次传代也可用，但是非二倍体细胞是绝对禁止使用的，因为担心异倍体细胞的核酸会影响到人的正常染色体，有致癌的危险。由于二倍体细胞传代不会超过50代，所以使用受到限制。后来发现异倍体也可使用，并未对机体产生影响，并且可无限使用，对工业生产带来了极大的方便。,二、获得,原代细胞、已建立的二倍体细胞系及可无限传代的转化细胞系。1、原代细胞直接取自动物组织、器官，经过粉碎、消化后获得的细胞悬液。需大量动物，费钱费劳力。,2、二倍体细胞原代细胞经过传代、筛选和克隆，从而从多种细胞成分的组织中挑选并纯化出某种具有一定特征的细胞株。特点：二倍体；有明显的贴壁和接触抑制特性；
8、有限的增殖能力；无致瘤性。,3、转化细胞系通过转化形成，变成了异倍体，有无限增殖能力。转化可自发，在传代过程中自己转变成可无限增殖的细胞；也可人为转化，采用某些试剂处理，或从动物的肿瘤组织中建立的细胞系。优点：无限传代、倍增时间短、对培养条件和生长因子的要求低，适合于大规模工业化生产。,三、生产常用动物细胞的特性,WI-38：人二倍体细胞系，成纤维细胞，能产生胶原，倍增时间为24小时，有限寿命50代，用于制备疫苗。MRC-5：人二倍体细胞系，成纤维细胞，有限寿命42-46代，用于制备疫苗。CHO-K1：从中国地鼠卵巢中分离的上皮样细胞，用于构建工程菌。,BHK-21：从地鼠幼鼠的肾脏中分离。成
9、纤维样细胞，用于构建工程菌，可生产疫苗。Vero：从非洲绿猴肾中分离，贴壁依赖的成纤维细胞，用于制备疫苗。Namalwa：从淋巴瘤病人分离，生产干扰素。SP2/0-Ag14：从抗羊红细胞活性的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞系融合获得，生产单克隆抗体。,四、基因工程细胞的构建和筛选,生产中常采用融合细胞或基因工程构建的工程细胞。,1、真核细胞基因表达载体的构建,常用病毒或质粒载体，用杆状病毒作载体的优点：该病毒基因是双链的容易进行重组；插入7-8千碱基对不影响正常病毒的形成；可用外源基因更换部分病毒基因，仍具有感染力；有很强的启动子；用光学显微镜可见，容易挑选阳性克隆；可直接表达外源基因。,构建穿梭质粒
10、载体的基本成分：允许载体在细胞内扩增的质粒序列；含有能使基因转录表达调控元件；能用以筛选出外源基因已整合的选择标记；有时还带有选择性增加拷贝数的扩增系统。,2、载体的导入和高效表达工程细胞的筛选,载体的导入可用融合法、化学法、物理法、病毒法。最常用磷酸钙沉淀和电穿孔法。,磷酸钙沉淀法,将溶解的DNA加在磷酸氢二钠溶液中，再逐渐加入氯化钙溶液，当磷酸氢二钠和氯化钙形成磷酸钙沉淀时，DNA被包裹在当中，形成DNA-磷酸钙共沉淀。当沉淀物与细胞表面接触时，通过细胞吞噬作用将DNA导入其中。优点是方法简单、可进行共转化，可将不含选择性标记的DNA和含选择性标记的DNA放在一起进行形成混合的共沉淀物，一
11、起导入细胞。,电穿孔法,借助电穿孔仪产生的高压脉冲电场，使细胞膜出现瞬时可逆性的小孔，外源DNA即可进入细胞。转化效率较高，但进入的DNA拷贝数较低。依靠构建载体内的选择性标记采用相应的筛选系统：HAT、GPT、G418、MTX筛选相应的转化细胞；对选出的细胞要进行克隆和亚克隆使其纯化。,五、细胞库的建立,除原代细胞外，其他细胞株、细胞系，包括二倍体、转化细胞、融合细胞和工程细胞都需建立细胞库保存。用于生产的工程细胞必须建立两个细胞库，原始细胞库和生产用细胞库。,原始细胞库应有详细档案：1、该细胞系的历史：来源、动物的年龄和性别、细胞分离的方法和所用的培养材料。2、该细胞的特性：形态、生长特性
12、。3、对各种有害因子的检查结果，细菌、真菌、支原体和各种病毒。,第四节 动物细胞的培养条件和培养基,一、动物细胞在体外培养所需条件1、所有的与细胞接触的设备、器材和溶液都必须保持绝对无菌，避免污染；2、必须有足够的营养保证，绝对不可有有害的物质，避免有害离子；,3、保证有适量的氧气供应；4、需随时清除细胞代谢中的有害产物；5、有良好的适于生存的外界环境，渗透压、离子浓度和酸度；6、及时分种，保持合适的细胞密度。,二、动物培养基的种类和组成,天然培养基合成培养基无血清培养基,血浆凝块、血清、淋巴液、胚胎浸液、羊水、腹水。,1、天然培养基,2、合成培养基,组成稳定、可大量生产供应。成分为氨基酸（细
13、胞合成蛋白质的原料）、维生素（维持细胞生命活动的低分子活性物质，形成酶的辅基或辅酶）、糖类（碳源）、无机盐（保持细胞的渗透压并参与代谢）、其他（前体和氧化还原剂）。,合成培养基中除了各种营养成分外，还需添加5%-10%的小牛血清，才能使细胞很好地增殖。,添加小牛血清的作用,1、提供有利于细胞生长增殖所需的各种生长因子和激素；2、提供有利于细胞贴壁所需的贴附因子和伸展因子；3、提供可识别金属、激素、维生素和脂类的结合蛋白；4、提供细胞生长所必需的脂肪酸和微量元素。,3、无血清培养基,无血清培养基在天然或合成培养基的基础上添加激素、生长因子、结合蛋白、贴附和伸展因子及其他元素。,无血清培养基的优点
14、,优点：1、提高了细胞培养的可重复性，避免了血清差异所带来的细胞差异；2、减少了由血清带来的病毒、真菌和支原体等微生物污染的危险；3、供应充足、稳定；细胞产品易于纯化；4、避免了血清中某些因素对有些细胞的毒性；5、减少了血清中蛋白对某些生物测定的干扰，便于结果分析。,第五节 动物细胞培养的基本方法,一、细胞分离二、细胞计数三、细胞传代四、细胞的冻存和复苏,一、细胞分离,1、离心分离法从含有细胞的体液如血液、羊水、腹水中分离细胞。800-1000转/分，离心5-10分。转速过高或时间过长会使细胞损坏或死亡。,2、消化分离法,先从生物体取来组织块，将其剪碎，并用消化液将其消化，使组织松散成细胞悬液
15、，然后用缓冲液洗涤，离心，去除残留的消化液而获得所需的细胞。常用的消化物：胰蛋白酶、EDTA、胰酶柠檬酸盐、胰酶EDTA等。,二、细胞计数,在细胞分离制成悬液准备接种培养前都要对细胞进行计数，然后按需要量接种于培养瓶或反应器中。在观察细胞增长变化以及药物对细胞的抑制作用时也常用到计数。常用方法：自动细胞计数器 血球计数板计数 结晶紫染色细胞核计数 MTT染色计数法,三、细胞传代,当细胞增殖到一定程度，由于营养条件、代谢废物、接触抑制等限制，需要及时分种，否则细胞会死亡、脱落，所以在培养过程中要及时传代。悬浮细胞的传代：将原培养瓶中的细胞悬液分种到几个装有新鲜培养基的培养瓶中。贴壁细胞的传代：先
16、消化再分种。,四、细胞的冻存和复苏,冻存为了长期让细胞存活即保存细胞，常采用液氮低温冻存（-196）。在冻存过程中，渗透压的改变会影响脂蛋白使细胞膜破裂，可适当加入保护剂，如甘油和二甲基亚砜，这些小分子容易渗入到细胞中。在冷冻过程中速度控制很重要，太慢会产生冰晶损伤细胞，太快不足以使水分排出。,冻存中应注意的事项,1、冻存的细胞应处在良好的营养状态，在冻存前一天要换培养液。2、细胞密度以1*1062*106个/mL 为好。3、冻存用培养基要和实际使用的一致，保护剂也需要除菌。4、分装安瓿若是玻璃材质，需要检验其密封性。5、标签上要写明细胞名称、编号和冻存日期。,复苏,复苏要做到快融。1、从液氮
17、罐中取出的安瓿要立即放入装有3740温水的搪瓷杯内，并搅动加速融化、2、用乙醇消毒安瓿外表。3、二甲基亚砜对细胞有一定的毒性作用，融化后将细胞立即离心，换新鲜培养液。,第六节 动物细胞的培养方法和操作方式,一、动物细胞的大规模培养方法根据培养细胞可分为原代细胞培养和传代细胞培养；根据培养容器和方式可分为，静止培养、旋转培养、搅拌培养、微载体培养、中空纤维培养、固定床和流化床培养；实际生产可分为悬浮培养、贴壁培养和贴壁-悬浮培养。,1、悬浮培养,优点：操作简单、培养条件均一、传质和传氧比较好，容易扩大培养规模，可借鉴细菌发酵的经验。缺点：体积小，较难采用灌流培养。常用反应器为搅拌和气升式。,2、
18、贴壁培养,优点：适用的细胞种类多，较容易采用灌流培养，达到高密度细胞。缺点：操作比较复杂，需要合适的贴附材料和足够的面积，培养条件不易均一，传质和传氧较差。,3、贴壁-悬浮培养,微载体培养。优点：可创造相当大的贴附面积，载体体积较小，比重较轻，在轻度搅拌下即可携带细胞自由地悬浮在培养基内，发挥悬浮培养的特长。,包埋和微曩培养包埋或包裹在凝胶载体和微曩内的细胞可获得保护，避免了剪切力的损害；可以获得较高的细胞密度；通过控制微曩膜的孔径可使产品浓缩在微曩内有利于下游处理；可采用多种生物反应器进行大规模培养。,多孔载体由实心微球向开放的内部相互连接的多孔微球的转变极大地增加了贴壁面积，其优点为：1、
19、提高细胞密度2050倍；2、同时支持悬浮与贴壁培养；3、很容易达到三维空间的细胞固定；4、到球体内的扩散路径更短；5、适于搅拌、流化床或固定床反应器；6、有良好的放大潜力；7、细胞免受剪切力的影响；8、可长期连续培养。,二、动物细胞培养的操作方式,分批培养半连续培养灌流式培养,分批培养,将细胞和培养基一次性加入反应器内，待培养结束后，放出培养液，进行提取。,半连续培养,细胞和培养基一起加入反应器后，每间隔一段时间取出部分培养物，再加入同样数量的新鲜培养基。,灌流培养,细胞和培养基加入反应器后，在产物形成过程中，不断取出培养基同时不断补充新鲜培养基。,灌流培养的优点,1、细胞可处于稳定良好的环境
20、中，营养条件好、有害代谢废物浓度低；2、可极大地提高细胞密度；3、产品在罐内停留时间短，可及时分离出产品并在低温下保存，有利于产品质量的提高；4、培养基的比消耗率低，产品质量高，成本降低。,第七节 动物细胞产品的纯化方法和质量要求,一、动物细胞产品常用的纯化方法1、离心纯化的早期阶段，用以去除细胞、细胞碎片或其他较大的杂质。常在低温下进行。2、离子交换层析根据各种蛋白质所带的电荷性质不同进行分离。,3、凝胶过滤根据各种蛋白质分子量大小的差异进行分离。4、亲和层析根据特异性结合的性质，如酶和底物，抗原和抗体。5、盐析和有机溶剂沉淀6、透析7、高压液相层析,二、动物细胞产品的质量要求,1、对工程细
21、胞的要求历史资料：来源、动物年龄和性别、细胞分离的方法和所用的培养基。细胞特性资料：形态、生长特征、细胞抗原、染色体等。无污染：细菌、真菌、支原体和各种病毒。,2、对生产工艺的要求,厂房条件符合国家规定，所用的一切原料、试剂都必须质量稳定可靠。在细胞培养中尽可能少用或不用小牛血清，必须用时需严格挑选，以防病毒和支原体污染。纯化过程要低温进行。纯化后的产品需经严格质量检测，合格后才可分装。,3、对产品的质量要求,纯度生物活性比活性稳定性临床前的安全性和有效性评价临床试验的安全性和有效性评价,第八节 动物细胞制药的实例,组织纤溶酶原激活剂（tPA）生产工艺：组织纤溶酶原激活剂是一种丝氨酸蛋白酶，它
22、与纤溶酶原亲和力低，而与纤维蛋白亲和力较大，后两者结合后形成的复合物可提高其与tPA的亲和力，使纤溶酶原活化为纤溶酶，后这可水解纤维蛋白，导致血栓溶解，故对血栓性疾病有较好疗效。人黑色素瘤细胞株培养后可产生大量的tPA，其培养液中tPA浓度可达到1毫克/升。,（1）、工艺流程,（2）、工艺过程,A、培养基：主要为Eagle培养基，其主要成分（毫克/升）为L-盐酸精氨酸21，L-胱氨酸12，L-谷氨酰胺292，L-盐酸组氨酸9.5，L-异亮氨酸26，L-亮氨酸26，L-盐酸赖氨酸36，L-蛋氨酸7.5，L-苯丙氨酸18，L-苏氨酸24，L-色氨酸4，L-酪氨酸18，L-缬氨酸24，氯化胆碱1，叶
23、酸1，肌醇2，烟酸1，泛酸钙1，盐酸吡哆醛1，核黄素0.1，硫胺素1，生物素1，氯化钠6800，氯化钾400，氯化钙200，七水硫酸镁200，二水磷酸二氢钠150，碳酸氢钠2000，葡萄糖1000。此外尚加入青霉素100单位/毫升，链霉素100单位/毫升及10%小牛血清。,B、tPA抗体制备：取人tPA或猪心tPA免疫家兔，按每只家兔2000-300微克计，用福式完全佐剂充分乳化注入家兔皮下，每隔两周再用100微克tPA加强免疫，共加强两次。然后取家兔血清，用50%硫酸胺盐析，沉淀于0度对生理盐水透析及Sephadex 75柱层析，得抗tPA的免疫球蛋白G。,C、抗tPA亲和吸附剂制备：取Se
24、pharose 4B用10倍体积蒸馏水分多次漂洗，布式漏斗抽滤，称取20克湿凝胶于500毫升颈烧瓶中，加蒸馏水30毫升，搅匀后，用2摩尔/升NaOH溶液调pH11，降温至18度，在通风橱中另取溴化氰1.5克于乳钵中，用30-40毫升蒸馏水分多次研磨溶解，将溴化氰溶液倾入三颈瓶中，升温至20-22度，反应同时滴加2摩尔/升NaOH溶液维持pH11-12，待反应液pH不变时，继续反应5分，整个操作在15分内完成。,取出烧瓶，向其中投入小冰块降温，永号垂熔漏斗抽滤，然后用300毫升4度的0.1摩尔/升碳酸氢钠溶液洗涤，再用500毫升，pH10.2，0.025摩尔/升硼酸缓冲液冲洗3-4次，抽滤洗涤，
25、最后转移至250毫升烧杯中，加50-60毫升上述硼酸缓冲液冲洗，即得活化的Sepharose 4B备用。,另取70-80克上述抗tPA 免疫球蛋白G溶于20毫升硼酸缓冲液中，过滤，滤液加至上述活化的Sepharose 4B中，10度搅拌反应16-18小时，次日装柱，用10倍柱床体积的pH10.2硼酸缓冲液以5-6毫升/分流速洗涤柱床，收集流出液，并测定A280，然后再依次用5倍柱床体积的pH10.0，0.1摩尔/升乙醇胺溶液及 pH8.0，0.1摩尔/升硼酸缓冲液充分洗涤，直至流出液A2800.01，所得固定化抗tPA的免疫球蛋白G即为tPA的亲和吸附剂，将其转移至含0.01%NaN3 pH7
26、.4,0.1摩尔/升磷酸缓冲液中，于4度储存，备用。,D、细胞培养：将人黑色素瘤种质细胞按常规方法消化分散后，洗涤及计数，稀释成细胞悬浮液，备用。另取5升玻璃转瓶，按每1平方米表面积2.5升比例加入细胞培养基，然后将上述细胞悬浮液接种至转瓶中，接种浓度为（1-3）103细胞/毫升，然后置于37度，二氧化碳培养箱中，通入含5%二氧化碳的无菌空气培养至长成致密单层后，弃去培养液，再用pH7.4，0.1摩尔/升磷酸缓冲液洗涤细胞单层2-3次，再换入无血清Eagle培养液继续培养。然后每隔3-4天即收获一次培养液，用于制备tPA，同时向转瓶中加入新鲜培养液继续培养。如此反复进行再培养，即可获得大量tP
27、A。,E、tPA的分离：向上述收集的细胞培养液中加入Aprotinin(蛋白酶抑制剂)至50KIU/ml及吐温80至0.01%，滤除沉淀，滤液稀释3倍，每10升培养液以5毫升/分流速进入tPA免疫球蛋白G-Sepharose 4B亲和柱。然后用含0.01%吐温 80，25KIU/mlAprotinin 及0.25mol/l硫氰酸钾的pH7.4，0.1摩尔/升磷酸缓冲液以同样流速洗涤亲和柱，以除去未吸附的杂蛋白及非特异性吸附的杂蛋白，最后用3摩尔/升硫氰酸钾溶液洗脱亲和柱，并以每管10-15毫升体积分部收集，合并tPA洗脱峰，装入透析袋内埋入PGEw20000中浓缩至原体积1/10-1/5，备用
28、。,F、精制：将上述tPA浓缩液进Sephadex G-150柱，然后用含0.01%吐温80的1摩尔/升碳酸氢胺溶液以2-3毫升/分的流速洗脱，并以每管10毫升体积分部收集，合并tPA洗脱峰；于冻干机中冻干即为tPA精品。,第八节 动物细胞制药的前景,一、提高产量、降低成本和改进质量方面的研究提高产量：即提高细胞表达的水平，选用合适的载体、宿主和表达方式。降低成本：需要改进培养基配方，尽可能采用廉价原料，开发化学限定培养基，同时还应从改变细胞代谢途径着手。改进质量：主要是糖基化质量问题，选用合适宿主、改变细胞的某些酶基因、改进控制培养条件使产物正确糖基化。,二、培养方式的选择,悬浮、贴壁、兼性分批、灌流驯化细胞改变原来贴壁、依赖血清的生长特性。,三、发酵过程的控制,发酵过程的影响因素很多：搅拌、溶氧、pH、温度、细胞代谢物中有害物质的累积等等。使细胞处于半饥饿状态可延长培养周期；提高渗透压可提高外源蛋白的表达。,产量高、成本低、产品质量与天然基本一样。转基因技术的开发研究，安全性的考察。,四、转基因动物的研究,五、组织工程的研究,组织工程是通过对细胞的大量培养，并用细胞直接作为一种治疗手段用于临床，或用培养的细胞进一步加工构成一种组织，如皮肤、肝脏、胰腺等用于临床治疗。,
