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1、脂联素基因去信号肽区原核表达及酶免检测方法研究,专 业：微生物学学 生：孙强 导 师：王云龙 教授,主要内容,研究背景目的及意义实验技术路线方法与结果创新与结论,研究背景,脂肪细胞中发现的唯一与肥胖呈负相关性的特异性血浆蛋白。肥胖、冠心病、型糖尿病患者血浆中的脂联素低于正常水平。编码人脂联素的apMI基因定位于染色体3q27上，长度为16kbp，包含3个外显子和2个内含子。人脂联素由244个氨基酸组成，由分泌信号序列、特异序列、胶原重复序列、球状序列等4个结构域组成，其中球状区(gADPN)是脂联素生物活性的关键部位。,脂联素(adiponectin),目的及意义,可作为冠心病、糖尿病的辅助诊
2、断依据，并对疾病发生进行有效的预警；可作为评价药物在治疗肥胖、冠心病和糖尿病疾病方面的效果；进一步研究脂联素作用机制提供方便；利用基因工程方法制备脂联素定量检测试剂盒中的标准品，提高了稳定性和生物安全性。,本研究建立的血浆脂联素酶免定量检测方法,实验技术路线,方法与结果（一）,人脂联素基因去信号肽区的克隆与鉴定,方法与结果（一）,总RNA浓度=OD260稀释倍数 40g/mlOD280=0.254，OD260=0.485RNA含量=0.485140=19.4g/mL纯度=OD260/OD280=0.485/0.254=1.910,人脂肪组织总RNA的提取,方法与结果（一）,2、PCR扩增目的基
3、因(678bp),M.DNA Marker DL 2000；1.PCRproduct;2.Negative control,3、重组质粒酶切鉴定,M.DNA marker DL 2 000;1.BamH+Xho digestion products,重组SADPN蛋白的诱导表达及纯化,方法与结果（二）,方法与结果（二）,1、重组菌BL21(DE3)/pET41a/SADPN诱导表达(54.5kD),M.Protein molecule weight Marker;1.Normal cell lysates control;2.cell lysates induced at 25 for 6 h
4、ours;3.Supernatant of cell lysates induced at 25 for 6 hours;4.Precipitation of cell lysates induced at 25 for 6 hours;,方法与结果（二）,2、重组SADPN蛋白活性鉴定,3、重组SADPN蛋白诱导表达条件的优化,诱导温度的优化,M.Protein molecule weight Marker;13.Supernatant of cell lysates induced at 25 30 3746.Precipitation of cell lysates induced at
5、 25 30 37,诱导时间的优化,14.Supernatant of celll lysates induced at 25 for(4/6/8/10)hours58.Precipitation of cell lysates induced at 25 for(4/6/8/10)hours,方法与结果（二）,1 2 3 4 5 6 7 8,诱导剂浓度的优化,14.Supernatant of cell lysates induced at 25 for(0.10/0.05/0.03/0.02)mol/LIPTG58.Precipitation of cell lysates induced
6、 at 25 for(0.10/0.05/0.03/0.02)mmol/LIPTG,方法与结果（二）,1 2 3 4 5 6 7 8,方法与结果（二）,M.Protein molecule weight Marker;1.Sample of impurification;2.Elution products with 20 mmol/L Imidazole;3.Elution products with 50 mmol/L Imidazole;4.Elution products with 100 mmol/L Imidazole;5.Elution products with 200 mmo
7、l/L Imidazole.,4、重组SADPN蛋白的纯化,方法与结果（三）,双抗体夹心ELISA检测方法的初步建立,方法与结果（三）,1、检测标准品的制备,2、标准品稳定性试验,t=1.112，显著性概率（Sig.）P=0.3090.05，表明在28和37放置144h检测结果没有显著性差异，制备的标准品稳定性较好。,方法与结果（三）,3、包被抗体和检测抗体最佳浓度的选择,方法与结果（三）,4、检测标准曲线的绘制,方法与结果（三）,5、精密性试验,6、方法对比试验,方法与结果（三）,，P=0.5300.05，两者检测结果之间没有显著性差异,创新与结论,成功构建了含有脂联素去信号肽区域的重组质粒
8、pET-41a/SADPN，实现了脂联素的可溶性表达；制备脂联素定量检测试剂盒中的标准品，建立了人脂联素ELISA定量检测方法；本实验所建立的人脂联素ELISA定量检测方法与国内上市同类产品的检测结果具有高度一致性，可用于临床检测。,致谢,本论文是在王云龙老师的悉心指导和亲切关怀下完成的，在此谨向导师表示深深的谢意和崇高的敬意！向培养我的母校和传授我知识的全体老师致以崇高的敬意，向研究生处的领导和老师们表示衷心的感谢！特别感谢河南省生物工程技术研究中心的各位老师和师兄师姐的指导和帮助！感谢所有关心帮助我的同学和朋友！感谢河南省重大科技攻关项目（项目编号：09210231 3110）对本论文的资金支持。,敬请各位老师批评指正！,非常感谢,
