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1、雌激素对脊髓损伤大鼠运动功能及GAP43表达的影响周邦瑜张磊李颖李绍波*(大理大学临床医学院，大理，云南，671000)作者简介：周邦瑜(1996年-)硕士研究生在读，主要从事脊柱外科研究。(Email：)联系电话：基金项目：云南省教育厅科学研究基金会项目(2022Y865)*通讯作者，教授，硕士研究生导师，【摘要】目的：探讨雌激素对脊髓损伤(SPinaICordinjUry,SCI)大鼠后肢运动功能和损伤区域生长相关蛋白-43(GrOWth-ASSoCiatedProtein43,GAP-43)表达的影响。方法：SD大鼠随机分为假手术组(A组)、生理盐水模型组(B组)、雌激素组(C组)，B、
2、C制作SCl模型，B组等量生理盐水腹腔注射，C组雌激素腹腔注射。术后3d、lw、2w、3w检测BBB评分和RiVIin斜板试验。术后各时间点处死大鼠取脊髓组织，行免疫组织染色观察GAP-43的表达情况，所有的结果采用单因素方差分析，进一步使用LSD法进行各组间比较。结果：C组BBB评分在术后lw、2w、3w评分结果分别为(9.670.30)分、(14.060.69)分、(16.460.39)分,B组分别为(4.280.15)分、(6.930.50)分、(8.950.34)分，相同时间点比较C组均比B组高，差异存在统计学意义CP0.05)；C组RiVlin斜板试验在术后lw、2w、3w评分结果分
3、别为(29.830.66)o、(40.160.76)o、(49.001.48)o,B组分别为(24.600.63)、(27.580.79)、(30.511.18),相同时间点比较C组均比B组高，差异存在统计学意义(P(18.78+0.37(9.870.44),B组分别为(15.930.59)、(26.450.69)(13.61+0.43)4.59+0.47),相同时间点比较C组均比B组高，差异存在统计学意义(PV0.05),结论：雌激素能促进脊髓损伤大鼠的运动功能的恢复，其机制可能是通过增加脊髓损伤区域GAP-43的表达，促进神经的修复和再生。【关键词】雌激素；脊髓损伤；运动功能；GAP-43
4、【中图分类号】R683.2【文献标识码】AEffectsofestrogenonmotorfunctionandGAP-43expressioninratswithspinalcordinjuryZHOUBangyuZHNAGLeiLIYingLlShaobot(CollegeofClinicalMedicine,DaliUniversity,Dali671000,Yunnan,China)Abouttheauthor:ZHOUBangyu(1996-)isapostgraduatestudent,mainlyengagedinspinesurgeryresearch.(Email：)Tel:
5、*Correspondingauthor,Professor,supervisorofspinalsurgery,(AbstractObjective:Toinvestigatetheeffectsofestrogenonhindlimbmotorfunctionandtheexpressionofgrowth-associatedProtein43(GAP-43)intheinjuredareaofratswithspinalcordinjury(SCI).Methods:SDratswererandomlydividedintoshamoperationgroup(groupA),nonn
6、alsalinemodelgroup(groupB)andestrogengroup(groupC).SClmodelwasmadeinBandC,andthesameamountofnormalsalinewasinjectedintraperitoneallyingroupBandestrogenwasinjectedintraperitoneallyingroupC.BBBscoreandRivlininclinedplatetestweredetectedat3rdday,lsl,2nd,3rdweekafteroperation.Theratsweresacrificedateach
7、timepointafteroperationandthespinalcordtissueswereharvestedforimmunohistochemicalstainingtoobservetheexpressionofGAP-43.AlloftheresultswasuseSinglefactoranalysisofvariancefirst,andthenLSDtestwasusedforpairwisecomparisonbetweengroups.Results:TheBBBscoresofgroupCat1sl,2nd,3rdweekafteroperationwereresp
8、ectively(9.670.30)(14.060.69)、(16.46+0.39),groupBisrespectively(4.280.15)、(6.930.50)、(8.950.34),atthesamepointintime,groupCwashigherthangroupB,thedifferencewasstatisticallysignificant(P0.05).IngroupC,thescoresofRivlininclinedplatetestat1sl,2nd,3rdweekafteroperationwererespectively(29.830.66)o、(40.16
9、0.76)o、(49.001.48),groupBisrespectively(24.600.63)、(27.580.79)、(30.511.18),atthesamepointintime,groupCwashigherthangroupB,thedifferencewasstatisticallysignificant(P(13.61+0.43)、(4.590.47),atthesamepointintime,groupCwashigherthangroupB,thedifferencewasstatisticallysignificant(P0.05).Conclusion:Theest
10、rogencanpromotetherecoveryofmotorfunctionintheratspinalcordinjury,itsmechanismisprobablybyincreasingtheexpressionofGAP-43oftheareaofSCI,promotingnerverepairandregeneration.Keywords:Estrogen;Spinalcordinjury;Motorfunction;GAP-43脊髓损伤（SPinaIcordinjury,SCl）是由多种因素引起损伤部位以下感觉、运动和自主神经功能障碍UZ,严重影响患者的健康和生活质量，治
11、疗主要有尽早的进行减压手术、使用激素、血管活性药物、细胞移植、神经刺激等方法14-61o雌激素是类固醇激素，研究表明可通过抑制神经元凋亡，有助于修复SCl后大鼠的运动功能，但雌激素是否能促进神经生长，目前研究并不透彻。生长相关蛋白43（GroWth-ASSc）CiatedProtein43,GAP-43）是神经元再生的标志物之一。雌激素能否调节GAP-43的表达、改善Sel大鼠运动功能目前报道较少，因此本研究拟通过雌激素干预SCl大鼠，探讨GAP43在雌激素改善SCl大鼠后肢运动功能中的作用，为SCl的治疗提供新的参考。1、材料和方法1.1 实验材料1.1.1 实验动物雄性SD大鼠72只，体重
12、200g-250g,随机分三组。A组为假手术组，仅仅打开椎板不做SCI；B、C两组建造SCl模型，其中B组为生理盐水模型组（等量生理盐水腹腔注射）、C组为雌激素治疗组（术后30min、Id、2d腹腔注射剂量为4mgkg己烯雌酚），B、C两组每组根据时间分为术后3d、lw、2w、3w共4个小组，每个小组6只。1.1.2 实验试剂己烯雌酚注射液（批号：100103,上海通用药业股份有限公司），抗原修复液、即用型SABC试剂盒、DAB显色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），戊巴比妥钠（北京化学试剂公司）。1.2 实验方法1.2.1 动物模型大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠40mgkg麻醉，A组仅打开T3
13、L5椎板，不做SCIoB、C两组根据改良AllenS重物打击法造模。以最后一根肋骨为标记，行背部正中切口，逐层分离椎旁肌肉暴露椎板，止血钳咬除T3L5全部椎板，显露出硬脊膜。硬脊膜表面放置贴合脊髓弧度的铜质垫片，距脊髓表面2cm的高度将直径为2cm、重量为20g的金属杆自由落体垂直的撞击垫片，损伤结束后逐层关闭切口。造模成功标准：大鼠脊髓受撞击后，脊髓组织出血、水肿，出现双下肢瞬时抖动和摆尾反射。术后每天一次腹腔注射青霉素8万单位预防感染，连续3天。1.2.2 BassoBeattieBresnahanscale（BBB）评分各组分别在SCl后3d、lw、2w、3w进行双盲法BBB评分并记录，
14、将大鼠放置在水平地面上行走，通过观察大鼠踝关节、膝关节、股关节的行走姿态和四肢整体运动协调动作情况进行评分1期。重复测量数据，取平均值。1.2.3Riylin斜板试验自制75CmX60CmX1.5Cm的长方形斜板测试大鼠在斜板上的抓握力、维持身体姿势的能力，记录斜板每次升高时大鼠停留5秒的斜板角度数值。各组分别于SCl后3d、lw、2w、3w双盲法重复测量数据，取平均值。1.2.4 动物灌注各组术后3d、lw、2w、3w不同时间点进行灌注，麻醉后暴露心脏，自制灌注器插入左心室、剪破右心耳进行灌注。先用PBS液灌注，接着快速灌注4%多聚甲醛，此时出现肢体和尾部抽动，抽动停止后持续缓慢灌注。大鼠肝
15、脏变白硬化，四肢及尾巴变硬时灌注结束。迅速以损伤点为中心取出约2cm脊髓，整个过程约40min01.2.5 免疫组织化学染色法(immunohistochemicabIHC)检测GAP43蛋白的表达脊髓组织行石蜡包埋，切片后烤片、脱蜡。过氧化氢孵育灭活内源性酶、抗原修复、5%山羊血清37孵育30min0轻轻甩去山羊血清后GAP-43抗体(1:50)37孵育30min,洗去一抗后二抗孵育30min,洗去二抗后SABC试剂孵育30minDAB染色IOmin,素木精染2min,再次脱蜡、封片。HMlAS-2000分析系统GAP-43阳性细胞重复计数，求其平均值。2 .统计学分析所有数据均通过SPSS
16、25.0软件完成统计和分析，实验数据用Sis表示，选用单因素方差分析(One-WayANOVA)进行多组间比较，进一步采用LSD法两两比较。P0.05表示差异具有统计学意义。3 .结果3.1 BBB评分各组术前大鼠BBB评分均为21分。B、C两组分别与A组比较，术后3d、lw、2w、3w的BBB评分均有显著性差异(PV0.01)；B、C两组在术后3d时相互比较，BBB评分无差异，无统计学意义；C组术后lw、2w、3wBBB评分均高于B组(PVO.01)；差异有统计学意义。见表1。表1大鼠脊髓损伤前后BBB评分（日出）（分）（n=6）术前preoperative术后3d3rddaypostope
17、rative术后IWls,weekpostoperative术后如2ndweekpostoperative术后3s3,weekpostoperativeA组21.000.0020.480.57*21.000.00i*21.000.004s21.000.00i*(GrOUPA)B组21.000.003.180.12*4.2X0.15*6.930.50*8.95034*(GroupB)C组21.000.003.270.15*9.67030*I4.060.69*I6.46O39*(GroupC)F5796.0511266.031187.812468.39P0.0010.0010.(MHO.(M)It
18、93.47147.0348.7469.57AvsBP0.0010.0010.001O.(M)ITable1BBBscoreofratsbeforeandafterspinalcordinjury(ls)(score)(n=6)AvsCtP93.010.(M)l99.680.00124.080.00126.27erative3rdWeeEMkratiVe单因素方差分析（LSD）：与A组比较，Pv0.0/；与B组比较，*P0.01.One-wayANOVA(LSD):ComparedwithgroupA,*P0.0/;ComparedwithgroupB,P0.01.3.2 RiVlin斜板试验各
19、组大鼠术前斜板实验结果均为（75.000.00）o,B、C两组分别与A组比较,术后3d、lw.2w、3w均有差异（PVo.0/）；B、C两组在SCl后3d时相互比较，斜板实验结果无统计学意义；C组术后lw、2w、3w斜板实验结果均高于B组（PV0.0/）；差异有统计学意义。见表2。表2各组不同时间RiVIin斜板试验(国s)(角度)(n=6)Table2Rivlinslantplatetestatdifferenttimeineachgroup(Sts)(Angle)(n=6)A组75.000.00475.000.00*75.000.00*(GroupA)75.000.0073.701.15*
20、B组术后3d术后IW术后2“术后3w75.000.0022.980.9824.600.63*27580.79,30511.18*(GroupB)3rddaypostoperativelrtweekpostoperative2ndweekpostoperative3rdweekpostoperativeC组75.000.0023.770.62*29.830.66*40.160.76*s49.00l.48*(GroupC)F5661.8916560.789046.932518.34P0.(M)l0.0010.0010.(M)lt92.87165.50129.8270.63AvsBP0,0010.0
21、010.0010.(M)lt91.43I4K3195.5241.27AvsCP0.(M)l0.0010.0010.(M)It1.4317.1834.4129.37CvsBP0.1720.0010,0010.(M)l单因素方差分析(LSD)：与A组比较，*Pv0.0/；与B组比较，*P0.0One-wayANOVA(LSD):ComparedwithgroupAjP0.01;ComparedwithgroupB.P0.01.3.3 GAP43定位及表达IHC染色可见浅褐色的GAP-43颗粒表达于脊髓神经元胞浆和轴突内。假手术组少量GAP-43表达，见图1-1。B组和C组大鼠GAP-43蛋白表达阳
22、性细胞数3d时增加，Iw时达到高峰，随后逐渐下降。B、C两组与A组术后3d、lw、2w、3w分别比较，B、C两组阳性细胞数均高于A组，差异有统计学意义(PVao5)。B组和C组相互比较，C组阳性细胞数在术后3d、lw、2w、3w均高于B组，差异具有统计学意义(PVo.05),并且C组着色深于B组。见表3,图1-2至图2至(s) (n=6)表3不同时间GAP43阳性细胞数(限)(n=6)Table3NumberofGAP-43positivecellsatdifferenttime图1-4： B组术后IW图1-2： B组术后第3天图1-5： C组术后IW图1-3： C组术后第3天图1-6： B组
23、术后2wA组(GroupA)2.200.66s2280.10*2310.17*2310.20*B组15.93*0.59*26.450.69*13.610.434.590.47,(GroupB)C的23.3K0.40*s3I.14O6*18.78*037*9.870.44*(GroupC)F2201.053504.213657.12599.44P0.0010.0010.0010.001t-42.40-6334-5733-10.19AvsBP0.0010.0010.0010.(MHt-65.40-78.00-83.63-33.75AvsCP0,0010.(MH0.001V0.001t23.0012
24、.6626.3023.57CvsBP0.0010.(MH0.001O.(MH单因素方差分析(LSD)：与A组比较，V0.0/;与B组比较，*P0.01oOne-wayANOVA(LSD):ComparedwithgroupAJP0.0.ComparedwithgroupB,P0.01.图1-7： C组术后2w图1-8： B组术后3w图1-9： C组术后3w图1免疫组化检测GAP43表达情况400Figure1ExpressionofGAP-43detectedbyimmunohistochemistry400注：图I-IA组，图1-2B组术后第3天，图1-3：C组术后第3天，图1-4：B组术后
25、Iw,图1-5：C组术后IW,图1-6：B组术后2w,图L7：C组术后2w,图1-8：B组术后3w,图1-9：C组术后3w。Note:Figure1-1GroupA,Figure1-2GroupBon3rddaypostoperative.Figure1-3:GroupCon3jdaypostoperative.Figure1-4:GroupBonls,weekpostoperative.Figure1-5:groupCon*weekpostoperative.Figure1-6:GroupBon2ndweekpostoperative.Figure1-7:GroupCon2ndweekpos
26、toperative.Figure1-8:GroupBon3lweekpostoperative.Figure1-9:groupCon3rdweekpostoperative.4.讨论雌激素可通过抑制炎症、减少氧化应激、同时促进血管生成、神经再生和神经营养支持，保护中枢神经免受损伤口”。在SCl大鼠研究中，雌激素可上调血管生成因子.血管内皮生长因子促进血管再生，并且减少了钙蛋白酶的表达和活性，减少神经元的死亡，恢复SCl大鼠的运动功能。RiVIin斜板试验和BBB评分均能反应大鼠的运功功能，RiVlin斜板试验主要针对大鼠抓握能力，不能很好的观察其精细动作，而BBB评分则刚好弥补了RMin斜板
27、试验的缺点，两者的实验结果评分越高表示大鼠运动功能越好。本研究实验结果显示雌激素治疗组术后3d、lw、2w、3w的BBB评分和RiVlin斜板实验结果都比生理盐水模型组高，说明经过雌激素干预能够明显的改善Sel大鼠后肢运动功能。AIIen飞法造成的脊髓损伤模型属于挫伤性脊髓损伤，损伤早期可导致组织水肿、坏死和出血，持续损伤可导致神经元水肿、甚至死亡，因此促进神经细胞修复再生是脊髓损伤治疗的策略。GAP-43是一种膜磷酸蛋白，广泛存在于神经元中，参与神经细胞的生长以及再生反应，可促进轴突的延伸，是轴突损伤和再生反应的关键蛋白W，。在SCl中GAP-43表达的升高，能促进损伤脊髓神经元的再生和修复
28、【。通过对本实验免疫组化染色的结果分析，雌激素治疗组GAP-43阳性细胞表达数在术后3d、lw、2w、3w时间点均比生理盐水模型组高，表明雌激素能增加GAP-43的表达减轻轴突损伤以及促进神经再生。结合BBB评分和Rivlin斜板实验结果，提示雌激素恢复SCl大鼠的后肢运动功能可能与GAP-43表达增多相关。综上所述，雌激素能提升BBB评分和RiVIin斜板实验结果促进脊髓损伤大鼠的运动功能的恢复。其机制可能是通过增加脊髓损伤区域GAP-43的表达，促进神经的修复和再生。【参考文献】1ZHANGY,MAMUNAA,YUANY,etal.Acutespinalcordinjury:Pathoph
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