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1、结核病的实验室诊断,主要内容,结核病的分子药敏,4,1.结核病的流行概况,全球范围内结核病疫情急剧恶化人口大规模流动结核菌耐药现象益发严重 结核病合并艾滋病感染我国是世界上仅低于印度的第二结核病大国结核菌感染率44.5%新发活动性结核患者130万/年死亡13万/年,2011 WHO tuberculosis control report,我国是全球27个耐药结核病高负担国家之一2013年世界卫生组织宣布全球耐多药结核病紧急状态,全球的结核病患者,在接受治疗之前已经传染给了别人！,早期快速诊断与治疗成为制约结核病控制的关键：有细菌学诊断依据的病人不超过50%,当前结核研究的热点,新型抗结核药物(
2、50%)新型快速诊断技术(40%)新型结核疫苗(10%),7/45,近期结核病诊断方法的相关研究,JID 2012:205(Suppl 2),S147.,2.结核病的病原学,结核分枝杆菌(M.tuberculosis)是引起人类结核病的主要病原体。1882年由德国医生Koch发现。结核分枝杆菌属于厚壁门、裂殖菌纲、放线菌目、分枝杆菌科、分枝杆菌属。分枝杆菌复合群共包括人型、牛型、非洲型和田鼠型，而人型结核分枝杆菌是人类主要的致病菌。,2023/10/21,GDTB,8,结核分枝杆菌(M.tuberculosis),生物学主要特点：1.细胞壁中含有大量脂质2.引起的疾病都呈慢性，并伴肉芽肿3.抗
3、酸染色阳性,生长特点：生长缓慢，繁殖一代在人工培养基内约需要1520小时，在静脉感染未经免疫小鼠肺中约需要15小时，在巨噬细胞内约需要1520小时，在家兔角膜中约需要2022小时。,实验室检查方法的历史,1880sTubercle bacilli的发现 Ziehl-Neelsen染色方法1900sMantoux test(TST with tuberculin)1920sPetragnani medium Purified Protein Derivative（PPD）1930sLewenstein-Jensen 培养基1940sDubos agar,Ogawa 培养基1950sMiddleb
4、rook 7H91990sNAAT2000sELISPOT,QuantiFERON,2010sLPA,GeneXpert2020s?,3.结核病的实验室诊断,细菌学,涂片：敏感性低,传统固体培养：所需时间长，23月,分子生物学,TB-DNATB-mRNA,血清/免疫学,IGRA：有望替代TST，但不能区分活动性TB与潜伏感染,血清学：存在抗原纯度和特异性差等方面的问题,液体培养及药敏试验：平均时间20天,.细菌学诊断,萋尼氏染色,荧光染色,罗氏培养/药敏试验,我国目前最常用的结核病实验室诊断技术,快培/药敏试验,涂片 干燥 固定,初染,脱色,复染,显微镜检查,登记/报告,显微镜检查,碱性复红,
5、盐酸酒精,亚甲兰,石炭酸金胺O,盐酸酒精,高锰酸钾,光学显微镜检查,荧光显微镜检查,萋尼氏染色镜下形态,荧光染色镜下形态,LED Fluorescence microscopyLED荧光显微镜,LED 荧光显微镜,成本低廉的超亮发光二极管可承受的价格，价格接近于现有的光学显微镜寿命长（15-20,000小时）省电可用电池供能可靠性更强不需要空调设施不需要暗室诊断性能优于标准荧光显微镜操作人员工作负荷减轻,普通荧光显微镜和发光二极管荧光显微镜性能比较（不同实验室的结果进行汇总与平均）,培养/药敏试验,阴性培养,阳性培养,BACTEC MGIT 960/320 指示器系统,MGIT/3D制造的液体
6、培养基,优点比固体培养快(平均 10-12 天 vs.20-24 天)比固体培养基更敏感可以自动判读，或使用标准指示管和操作手册进行判读也加快了药敏试验的速度局限需要NALC-NaOH进行痰处理和离心普通菌群的污染很常见比固体培养更经常地检出非结核分枝杆菌（常常不致病）确定诊断前必须对所有的阳性培养物进行结核分枝杆菌的鉴定比固体培养基昂贵,血清学诊断,血清学诊断技术优势：是一种对疾病进行早期诊断的理想方法。无需活细胞培养和特殊仪器设备操作简便结果显示快速目前用于血清学诊断的主要方法:酶联免疫吸附试验(ELlSA)斑点金免疫渗滤法(DIGFA)免疫印迹法(Western Blotting)等等,
7、WHO对来自不同国家的19种试剂盒产品进行评估，结果表明：与痰培养相比，这些试剂盒检测的灵敏度为1%60%，特异度为5399%1。原因：由于所用的测定方法、使用的试剂种类或抗原、抗体的不同等，导致测定结果差异较大，并且缺乏可比性。WHO认为现有的血清学诊断试剂的敏感度和特异度都有待进一步提高，不推荐其作为一种快速诊断的方法在临床使用。1WHO World Health Organization.Diagnosis evaluation series No.2:laboratory-based evalution of 19 commercially available rapid diagno
8、stic tests for tuberculosis.2008.,WHO对结核抗体评估,2011年WHO正式公告：由于目前的商业血清学试剂在结核检测中存在较大差异，且检测结果很高比例的假阳性和假阴性，因此不建议使用血清学方法作为结核杆菌的诊断实验1。1WHO Commercial Serodiagnostic Tests for Diagnosis of Tuberculosis.不能早期诊断！容易漏诊、误诊！,血清学检测的评价,结核感染者体内存在特异的效应T淋巴细胞，效应T淋巴细胞再次受到结核抗原刺激时会分泌多种细胞因子（IFN-）。因此，检测效应T淋巴细胞可用于结核病或结核潜伏感染者的诊
9、断。由于效应T细胞存活时间很短，而且具有特异性，因此可以作为机体是否正处于被感染的指标，无论是否有临床症状。基于IGRA原理的产品目前已被美国、加拿大、英国、德国、意大利、瑞士、法国、荷兰、日本等二十余个国家写入本国的结核诊疗指南中。目前应用的进口IGRA主要有两种商品化的试剂：1）澳大利亚Cellestis公司的 Quanti FERON-TB GOLD In Tube（QFT-GIT）2）英国Oxford Immunotec公司的T-SPOT.TB,蛋白水平分子诊断:-干扰素释放实验（IGRA),-干扰素释放实验（IGRA）,干扰素检测阴性,干扰素检测阳性,T-SPOT.TB原理,T-SP
10、OT.TB是以拥有专利的特异抗原（ESAT-6/CFP-10），通过酶联免疫斑点技术（ELISPOT）检测受试者体内是否存在结核效应T淋巴细胞，从而判断目前该受试者是否感染结核杆菌（现症感染）的新方法。结核杆菌特异抗原：早期分泌抗原靶6（Early Secreted Antigenic Rarget 6，ESAT-6）培养滤液蛋白10（Culture Filtrate Protein 10，CFP 10）,结核杆菌特异抗原,由结核杆菌基因组RD1区相同的操纵子编码的蛋白所有的卡介苗（BCG）均丢失该基因序列绝大多数的环境分枝杆菌也不存在RD1区,ESAT-6与CFP-10抗原,结核杆菌特异抗原
11、,苏氏,海,堪萨斯,戈登,牛,非洲,T-SPOT.TB临床性能指标,特异性只针对结核分枝杆菌复合群敏感，与绝大多数环境分枝杆菌和卡介苗（BCG）无交叉反应 美国FDA数据：特异性97.1%(297/306)国内临床数据：特异性94.1%(478/508)灵敏度基本不受免疫力低下/受抑制影响，在肺外结核患者中有很高的检出率 美国FDA数据：灵敏度95.6%(175/183)国内临床数据：灵敏度95.3%(624/655),灵 敏 度,特 异 性,T-SPOT.TB的实验步骤,用BD CPT 管或Ficoll提取液收集外周血单个核细胞,结核特异抗原（ESAT-6/CFP 10）刺激结核特异的效应T
12、淋巴细胞使其分泌-干扰素,效应T淋巴细胞分泌的-干扰素与膜板预包被的抗-干扰素抗体结合并固定在细胞周围,1个斑点=1个效应T细胞,加入显色液，观察结果,过夜孵育，洗板，加入酶标二抗,实验效果图,方法学的优点,检测特异性的提高帮助临床区分卡介苗接种和环境分枝杆菌感染引起的“假阳性”，避免了临床的无效用药检测灵敏度的提高有利于临床对结核病的早发现、早治疗，避免了疾病的传播与扩散快速48小时出结果,方法学的局限,不能区分活动性TB与潜伏感染不能够提示临床患者的病变部位，需要结合临床的判断目前还不能够根据斑点数量的多少来判断患者是活动性结核病或是潜伏感染者检测收费高（800元/次）,实验结果的解释,阴
13、性结果提示患者体内不存在针对结核杆菌特异的效应T细胞。假阴性结果：感染阶段不同；少数免疫系统功能不全/疾病；实验非正常操作。阳性结果提示患者体内存在针对结核杆菌特异的效应T细胞，患者存在结核感染。但是否是活动性结核病，需结合临床症状和其它检测指标综合判断。假阳性结果：4种环境分枝杆菌感染时：M.kansasii（堪萨斯）、M.szulgai（苏氏）、M.marinum（海）、M.gordonae（戈登）,各国对潜伏感染风险人群的筛查指南,样本量为26 680 调查者的15个多中心研究显示,在4年的随访中,IGRA-阳性的个体中发病数为448 例/1000人/每年.,2011年9月的研究结果提示
14、，IGRA-阴性对于儿童（小于5岁）不能排除结核病(Pediatr.Infect.Dis.J.30,817818,2011).Childhood tuberculosis treatment remains imprecise scienceNature MedicineVolume:17,Page:116011 October 2011.,TB-DNA检测：1.能稳定检测10copy的TB-DNA，灵敏度高，特异性强。2.早期、快速、准确地诊断结核病。痰液、肺及支气管灌洗液肺结核 血液播散性结核和各脏器的结核病 脑脊液中枢神经系统结核病 宫颈拭子、尿道拭子泌尿生殖道结核病3.荧光定量PCR检
15、出结核杆菌阳性率显著高于痰涂片抗酸染色和改良罗氏培养法。4.TB-DNA浓度可用于判断疗效：痰标本中结核杆菌的数量呈逐渐下降趋势，TB-DNA拷贝数下降。根据病原体DNA浓度，对药物治疗及疗效观察提供参考依据。,分子生物学诊断,Real-time PCR,环介导等温扩增法(LAMP)的技术特点是针对靶基因的6个区域设计4 条特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件(63-65)下保温3060分钟，即可完成核酸扩增反应。与常规PCR相比，不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程，具有简单、快速、特异性强的特点。,环介导恒温扩增（LAMP）技术,2小时全过程,目测法检测流程,检测方
16、法说明,结果判断,在阴性对照反应管液体颜色呈橙色，阳性对照反应管液体颜色呈绿色的条件下：若待检样本反应管中液体颜色呈绿色，则可报告该样本检测结果为结核分枝杆菌阳性；若待检样本反应管中液体颜色呈橙色，则可报告该样本检测结果为结核分枝杆菌阴性；若阴阳性对照反应管结果与上述情况不符，则本次检测结果无效，应重新检测。,RNA作为临床分子诊断靶标的优点：,RNA 拷贝数 DNA拷贝数更具临床意义:生命力旺盛的病原体RNA转录活跃RNA远不如DNA稳定病原体死亡，RNA很快降解 1.交叉污染少 2.较好的愈后指标,结核杆菌RNA(TB-RNA),SAT技术原理,操作过程,4.结核病的分子药敏,HAIN 技
17、术,DNASTRIP,T-spot,-Xpert MTB/RIF,DNA微阵芯片,探针熔解曲线技术,原理：采用线性探针技术（LiPA），扩增后的产物与预先固化在膜上的特异性探针杂交，通过显色反应判断结果。检测标本：涂阳痰标本/TB-DNA阳性标本固体或液体培养菌株,Hain 技术,GT-Blot 48自动杂交仪1台,所需设备：,GTQ PCR96扩增仪1台,Mikro 220 离心机1台,恒温器1台,超声波振荡仪1台,TARGET,MTBDRplus 方法,原理：PCR扩增检测rpoB、katG和inhA基因突变位点，诊断RFP和INH耐药。,rpoB 野生型探针:WT1-WT8rpoB 耐药
18、突变探针:MUT1-3:D516V,H526Y,H526D,S531L 通过缺失的野生型信号进行突变探测 通过出现的突变信号进行突变探测,MTBDRplus rpoB,MTBDRplus 操作流程,DNA提取用NALC/NaOH处理痰标本,2)PCR扩增,3)杂交扩增产物和固化在膜上的特异性探针杂交,4)结果判读,MTBDRplus 反应条带(示范),Bandelette MTBDR(Hain Lifescience),鉴定结核菌,利福平rpoB,INHkatG 315,灵敏度：86.5%(45/52)特异度：100%(16/16)符合率：89.7%(61/68),菌株标本 GenoType
19、MTBDRplus方法与比例法药敏试验结果比较,灵敏度：98.0%(48/49)特异度：100%(16/16)符合率：98.5%(64/65),菌株标本 GenoType MTBDRplus方法与比例法药敏试验结果比较,痰标本（涂片阳性）GenoType MTBDRplus方法与比例法药敏试验结果比较,灵敏度：98.4%(63/64)特异度：100%(129/129)符合率：99.5%(192/193),痰标本（涂片阳性）GenoType MTBDRplus方法与比例法药敏试验结果比较,灵敏度：95.1%(39/41)特异度：92.1%(140/152)符合率：92.7%(179/193),优
20、点：Hain 技术可以快速检测RFP和INH的耐药时间短、操作简单、安全高 特异性和灵敏度较高、重复性好主观因素影响小、更为可靠,缺点:需要专门设备；未发现所有的耐药突变位点，不能检测所有药物的耐药基因型；MTBDR plus试剂盒的检测试纸条，缺少ahpC-oxyR间隔序列范围，否则可进一步提高INH耐药检测的敏感性；不能取代传统细菌学检测、只能作为参考。,进行标本处理、实时PCR和利福平耐药性检测的完整平台此平台由FIND和Cepheid（一个加州公司）所开发痰标本可以直接放入模块中，而无需与任何试剂进行混合处理GeneXpert 设备可进行标本液化、去污染、富集、DNA提取、rpoB实时
21、扩增、应用分子灯塔检测耐药相关的突变该系统非常容易使用，不需要进行分子生物学培训该检测方法另外一个特点是操作完全自动化，使用起来既容易又安全。,.Xpert MTB/RIF,设计五个重叠的分子信标，检测81碱基 rpoB核心区域所有可能的突变用不同的荧光基团标记每个分子信标，使仅在一个反应中完成整个检测成为可能探针能检测野生型菌株（RIF-敏感人群）；ropB突变造成特定信标的信号丢失（RIF-耐受人群）每个探针必须：能检测野生型菌株；不能检测Rif耐药突变菌株，不能检测出非TB分枝杆菌.,Xpert MTB/RIF的引物设计,Xpert MTB/RIF,WHO推荐,Xpert MTB/RIF
22、 与 Hain的比较：,只能做TB-DNA和利福平耐药基因；只能通过8个缺失的野生型信号进行突变检测，不能探检测出现的突变信号；样本通量少(4个/次）；所需样本量大（1mL/次）；仪器断电后只能重新开始；Hain有记忆功能。维护：刚进入中国市场，故障后只能返厂修理，费用昂贵。,.DNA微阵芯片,基本原理：与Southern、Northern是一致的，都是应用已知核酸序列作为探针固定在玻璃等基片上，然后与待测样品的DNA或RNA互补的靶核苷酸序列杂交，从而获得待测样品的信息,基因芯片的检测过程,结核耐药快速检测基因芯片,73,结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒（DNA微阵列芯片法）基于rpoB/ka
23、tG/inhA的基因突变，快速检测分离株或者痰样本中结核分枝杆菌多药耐药（利福平、异烟肼）通 量：两种一线抗结核药物、8个突变位点速 度：6小时versus 传统 48 周灵敏度：103 CFU/反应特异性：防污染体系；对照设计严谨；自动判读,发表文章：The International Journal of Tuberculosis and Lung Disease.2009,13(7):914920.发明专利：申请号：200810105172.X。授权公告号：CN 101285062 B。,1.晶芯分枝杆菌核酸检测试剂盒2.晶芯十七种分枝杆菌菌种鉴定试剂盒3.晶芯分枝杆菌耐药检测试剂盒4.晶芯九项遗传性耳聋基因检测试剂盒,DNA微阵芯片,.探针熔解曲线技术,检测结果判断,Sputum,涂片,培养孵育8周（阳性）,药敏试验观察 孵育4周观察生长情况,涂片/TB-DNA/TB-RNA（阳性）,分子诊断/药敏技术,液体培养及药敏试验,平均时间2-3个月,平均时间20天,只需1-2天,小 结,感 谢 聆 听！,
