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1、微生物的培养和利用,第二节 大肠杆菌的培养和分离实验,思考？1.培养大肠杆菌需要配制培养基，培养基中应该添加哪些营养成分？培养基如何灭菌？2.若大肠杆菌和其他微生物混杂在一起，如何获得大肠杆菌纯种？获得纯种后如何保存？3.如何处理大肠杆菌便于在显微镜下观察？,实验主要原理,1.培养大肠杆菌的原理：大肠杆菌的代谢类型为异养、兼性厌氧型，培养基中应加入有机碳源、氮源、水和无机盐。培养时应提供有氧环境。牛肉膏蛋白胨培养基配方：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，（20g琼脂）加水定容至1000mL,2.平板划线法分离大肠杆菌的原理,用接种环在固体培养基表面连续划线，将聚集的菌种逐渐稀释分散到培养基
2、的表面。经多次划线后，可以分离由一个细胞繁殖而来的单菌落,此法可将细菌分为两大类：不被脱色而保持蓝紫色者为 革兰氏阳性菌（G+）；被脱色后又被染上红色者为 革兰氏阴性菌（G-）。,大肠杆菌(革兰氏阴性菌),金黄葡萄球菌(革兰氏阳性菌),细菌先经碱性染料结晶紫染色，再经碘液媒染（以增加染料与细胞的亲和力）后，用酒精或丙酮脱色，再用番红复染。,3.革兰氏染色，使大肠杆菌便于观察的原理,实验目的 1.配制牛肉膏蛋白胨固体、液体培养基，进行高压蒸汽灭菌 2.掌握倒平板技术。3.利用液体培养基进行大肠杆菌的扩增。4.用平板划线法在固体培养基上进行接种 5.培养微生物并观察大肠杆菌的单菌落 6.显微镜下观
3、察大肠杆菌的形态 7.利用斜面培养基和划线获得的单菌落进行纯培养。,斜面大肠杆菌菌种,实验流程,LB液体,LB固体50ml,培养基配 制和灭菌,用于大肠杆菌扩增,扩大培养（代替斜面菌种）,倒平板，大肠杆菌划线培养,获得单菌落（纯种分离）,100mL,5mL,挑取单菌落或液体培养基，制片，显微镜下观察大肠杆菌,1.培养基的配制和灭菌,称量,溶化,称量溶化调pH 分装高压蒸汽灭菌搁斜面,分装,加棉塞,包扎,高压蒸汽灭菌,搁置斜面,2.无菌操作倒平板,3.平板划线法接种,4.37恒温箱中倒置培养1224h,倒置培养的原因：培养基中的水分会以水蒸气的形式蒸发，并凝结成水滴留在培养皿的盖上；水蒸气形成的
4、水滴会落入培养基表面并且扩散开。如果培养皿中已形成菌落，则菌落中的菌会随水扩散，菌落间相互影响，很难再分成单菌落，达不到分离的目的。,5.利用液体培养基扩大 培养大肠杆菌,摇床上震荡培养 目的：,6.显微镜下观察染色后 的大肠杆菌,增加溶氧 使菌体和培养液充分接触,实验结果观察和分析,1.观察平板划线法获得的单菌落,请分析没有出现单菌落的可能原因？,菌液浓度大 划线次数少 培养时间长,2.观察液体培养基的浑浊度,空白培养基,生长细菌的培养基,3.显微镜下观察经革兰氏染色的大肠杆菌,1.平板划线法,分离微生物纯种的方法,2.液体稀释涂布法,1.实验结束后，用过的细菌培养基等如何处理？,思考与讨论,加热灭菌后废弃，不能直接倾倒到无机环境中，防止细菌 污染,2.如何保存菌种？,在无菌操作下将单菌落用接种环取出，再划线接种在空白 斜面上，37培养24h后，4冰箱保存。,3.未接种的培养基表面有菌落出现，说明什么问题？,培养基灭菌不彻底,4.在培养后如何判断是否有杂菌污染？,如出现不同形态、颜色、粘稠度的菌落可能被污染,
