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1、实用组织化学技术,细胞化学和组织化学cytochemistry and histochemistry是以细胞学、组织学为基础，运用物理的和化学的技术方法显示细胞组织结构中各种化学成分，并对这些化学物质进行定性、定位、定量（半定量），从而分析研究生物在生理或病理状态下细胞组织的代谢、机能及形态变化规律。其在医学研究中具有广泛的应用价值。,细胞和组织化学方法其原则上是运用已知的化学反应过程使细胞组织内的各种化学物质在原位形成可见的最终有色产物。光学显微镜观察显微镜细胞组织化学 电子显微镜观察电镜细胞化学 免疫技术方法 免疫组织化学 免疫电镜细胞化学 用细胞和组织化学方法显示细胞组织结构中各种酶的定
2、性、定位、定量酶组织化学酶组织化学宏观酶组织化学 光镜酶组织化学 电镜酶组织化学,小脑挫伤，苏木素伊红染色（HE）,酶组织化学染色脱氢酶NBT,NBT:,酶组织化学染色SDH,细胞和组织化学方法研究的范围1.组织细胞中的无机物质：主要包括钾、钙、锌、铜、汞等金属；氯化物、磷酸盐等盐类；以及各种无机放射性物质等。2.组织细胞中的有机物质：主要包括中性脂肪、磷脂类、胆固醇、中性和酸性粘多糖类、糖原、粘液蛋白、淀粉、类淀粉物质、黑色素、脂褐素、胆色素、氨基酸、肽、蛋白质、DNA、RNA、各种维生素等。3.组织细胞中各种酶类：如碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、胆碱酯酶、细胞色素氧化酶、琥珀酸脱氢酶、乳酸脱氢酶
3、等-蛋白质。,细胞和组织化学方法的特点:1.必须最大限度地保存细胞和组织中各种化学成分和/或酶的活性，以保证定性、定量研究；2.必须最有效地保持细胞组织固有的形态结构，以保证化学成分和各种酶在细胞组织中的定位；3.必须掌握被检测的化学物质特性，如水溶性、脂溶性、溶解度及特异反应等；4.必须掌握被检测各种酶的特性，如酶的功能、酶存在的特定部位、酶反应的适宜温度和酸碱度、酶的特异激活剂和抑制剂、影响酶活性的因素等；5.必须做对照实验，借助阳性和阴性对照，正确分析实验结果，注意识别假阳性结果。,细胞和组织化学方法的基本技术,取材固定水洗脱水透明浸蜡与包埋切片染色:脱蜡、脱苯、水化、染色、脱水、透明封
4、片,一、取材,基本要求：取材是否正确、恰当，直接影响切片的制作及正确诊断。1取材越快越新鲜越好，防止组织自溶、腐败。2取材刀要锋利，切取时刀口垂直地切取；严禁挤压，严禁用钳镊钳夹，以免使组织或细胞变形造成人为的损伤。3取材大小，一般长l-3厘米，宽1-2厘米，厚度为厘米。科研用光镜标本不超过1cm 1cm 1cm，电镜标本直径约0.5mm。过大材料在短时间内不易固定透，影响效果。4 要兼顾病变部位与正常部位。5 尽可能在低温条件下操作，04。,各器官取材方法：脑：取材应能反应出脑各部位的变化，一般采用冠状切面法，全脑包括（桥脑、延脑、小脑和脊髓颈段及脉络丛）。取材部位如下：额极；中央前后回；海
5、马；内囊；丘脑；枕叶；脉络丛；中脑；桥脑；延髓；小脑；脊髓颈段。取材时要包括软脑膜、室脑膜或软脊膜（刀要锋利）。垂体：取垂体时注意前、中、后叶和垂体柄都要兼顾，从前向后纵切。,心：一般悄况下将心房、瓣膜、心室一起取下。也可分别取一块病变部位连同正常组织。也可单独取心室肌，乳突肌组织。肺：常规取材应包括左、右两肺（五个肺叶），可根据病变需要决定取材块数，特殊情况下为区别在哪个肺叶上取的材可用形状做标志，在记录时记清楚。肾：取材包括被膜、皮质、髓质和肾盂，并要求区别左、右肾。胰：常规取胰体部，为长方形必要时加取胰头、胰尾。肝：取长方形或三角形均可，带被膜。脾：取材带被膜。,管腔脏器：取材时注意方向
6、大、小肠：考虑环行肌肉，沿肠管的长轴取（纵切）；食管：以横切面为宜；胃：常规取材以胃底为好；气管：横切、纵切均要有。总之管腔脏器的各层构造都要取到。为了防止标本入固定液后变形，将材料取下后（如剪开的大小肠、胃等组织）将浆膜面铺在滤纸上，然后入固定液内，这样能防止或减少组织受压变形与收缩。,二、组织固定,组织固定的意义：组织固定是做好切片的重要步骤之一，如果首次固定失败，再重新固定也不如一次固定成功好，无法补救。处死动物立即取材，这时组织及细胞在一定时间内仍然延续着生命活力。迅速将其固定能有效地防止组织及细胞发生死后的一系列变化。固定的关键在于取材后尽可能地及时地将取到的材料进行固定，抑制其死后
7、变化的进展，尽力使组织接近于生前状态。另外，在标本制做过程中经过许多步骤，为了防止组织成份的溶解消失，有必要及时转变为不溶性物质，从而有利于保存。,组织固定的目的：阻止死后变化，防止组织的自溶与腐败。使组织的结构保存下来，如蛋白质，脂肪、糖元、酶等各种成份与生活时的形态相仿。便于染色，同时对组织有媒染作用，使不同的组织成份对染料有不同的亲和力，使细胞各部易于受色。能使组织硬化，为做薄切片打下基础。,组织固定的注意事项：.材料块不能过大；固定器皿不易过小；固定液量不易过少，大约是固定材料体积的2040倍。.根据检验目的不同选择不同固定液，如做糖元检查就不能用含水的固定液，做电镜检查就必须用锇酸固
8、定液等。,固定液：用以固定组织的药剂。固定液分为两大类：单纯固定液：仅由一种药剂组成。混合固定液（或复合固定液）：由二种以上的药剂组成的固定液。固定液选择标准：具有强的穿透力，固定均匀，能迅速渗透组织内部，使组织细胞结构保持生活时期的相仿状态。不使组织过度收缩与膨胀而变形。能迅速使组织中的蛋白质，糖、脂肪等物质凝固而成为不溶性物质。使组织达到一定的硬度，便于切片制作、染色。价格便宜，容易买到，同时要配制方便。,常用的单纯固定液乙醇（酒精）alcohol 甲醛（福尔马林）（缓冲液配制）formalin重铬酸钾 potassium bichromate 苦味酸 picric acid锇酸 osmi
9、c acid 丙酮 acetone 冰醋酸 glacial acetic acid 多聚甲醛缓冲固定液 paraformaldehyde戊二醛磷酸缓冲固定液 glutaric dialdehyde,1.乙醇（酒精）Alcohol它是一种还原剂，不能与氧化剂混合使用。固定用酒精最好浓度在7 080，酒精浓度愈大，组织收缩愈严重。反之，浓度太低起不到固定作用。由于酒精能沉淀白蛋白，球蛋白和核蛋白，而后者的沉淀物易溶于水，所以用酒精固定的标本细胞核染色不佳；酒精还可溶解脂肪、血红蛋白和多种色素。所以做脂肪染色必须要用冰冻切片。,乙醇优点：使用方便、经济，国内市售有：95 的乙醇和无水乙醇（100）；
10、能硬化组织，起固定作用；也是一种最常用的脱水剂缺点：穿透力小，由于表面硬化，固定液不容易渗透到组织中去，所以用乙醇固定的组织材料要小；组织收缩严重;染色效果一般。,2.甲醛（福尔马林）formalin是一种还原剂，不能与氧化剂混合使用。它是一种最常用的固定液，可应用于组织学、酶组织化学、免疫组织化学等染色，最好临用时现配。目前认为甲醛是一种致癌剂、致畸剂等。甲醛液是一种无色透明极易挥发有强烈刺激性气味的液体。商品甲醛为3740甲醛水溶液，也即福尔马林。一般固定用配制的浓度为48，习惯上称为10或20的福尔马林。此液可按前述取材大小在常温下固定24小时48小时。若需要快速固定，可加温到7080或
11、者加温煮沸10分钟即可达到固定要求，这种快速固定组织块不宜过厚或过大。缺点是组织收缩较严重。,配法：将商品甲醛1份与9份自来水（最好用PBS等缓冲液配制）混合即为4浓度的甲醛固定液。优点：渗透力较强；组织收缩小；细胞核染色较好。缺点：一般质量较差的Formalin在低温下久存容易产生一种白色的沉淀物，称为三聚甲醛，即付醛。后者经氧化便成为甲酸而使溶液呈酸性，可影响细胞核的嗜硷性染色。纠正办法：可在备用甲醛溶液中放入适量的碳酸钙、碳酸镁或简便的办法可在溶液中投入适量的大理石或者白粉笔作为中和剂。另外酸性福尔马林固定的组织多易产生一种褐色或黑色素称福尔马林色素，在切片上见到的是黑色小颗粒，这种色素
12、颗粒即不溶于水也不溶于酒精，影响染色效果和切片的观察。,除掉福尔马林色素颗粒的办法：Schridde氏法2 5氨水 lml75酒精 200ml切片脱蜡后经70酒精时用上液浸泡半小时或稍长一些时间，然后水洗再行染色。Verocay氏法l氢氧化钾 lml70酒精 100ml切片脱蜡后经 8 0酒精时入上液处理10分钟，再经70酒精入水。,3.锇酸（四氧化锇，osmic acid）它并不是酸，实际上是一种金属氧化物，其水溶液呈中性反应，为淡黄色结晶，价昂贵，只适用于特殊染色中，如制作电镜超薄切片前的小组织块固定。锇酸为强氧化剂，不可与酒精及甲醛混用。锇酸极易挥发，气味有强烈的刺激性和固定作用，用时必
13、须十分小心，要有防护措施。特点：它固定的组织必须小而薄，其主要优点是能将组织固定与生活时期相仿。锇酸为脂肪及类脂质的优良固定剂，特别对显示线粒体及内质网等细胞器有良好的效果。配制：电镜超薄切片的小组织块后固定用锇酸浓度为1%。0.2mol/L 磷酸缓冲液 pH7.27.4 10ml+2%四氧化锇水溶液 10ml。,4.丙酮 acetone丙酮能使蛋白质沉淀，其渗透力强但对组织收缩严重；对细胞核的固定欠佳。目前在组织化学中，特别是酶的保存方面多采用冷丙酮固定法，主要用于磷酸酶及氧化酶的固定，有时也用于混合固定液中。,5.多聚甲醛缓冲固定液 paraformaldehyde多聚甲醛 4g，加入0.
14、1mol/L磷酸缓冲液 pH7.2 100ml中，加热6080溶解。固定15min24h,04。主要用于科研组织标本的固定，尤其用于免疫组织化学染色的组织固定，保护抗原决定簇不被封闭。6.戊二醛磷酸缓冲固定液 glutaric dialdehyde 25%戊二醛10ml，加入0.1mol/L磷酸缓冲液 pH7.27.4 90ml中。固定时间为60min,04。主要用于科研组织标本的固定，尤其用于电镜超薄切片的小组织块标本的初固定。,常用混合固定液：种类很多。可根据检查目的不同选择不同的固定液。1.Zenker固定液：重铬酸钾 2.5 g升汞（氯化高汞，HgCl2）5 g蒸馏水 100 ml冰醋
15、酸（临用时加入）5 ml,配制方法：首先将重铬酸钾、升汞和蒸馏水混合后加温溶解，冷却后过滤，置于棕色玻璃瓶中避光保存，这种配制的液体一般称为Zenker氏干液（储存液、底液）。此液较为稳定，即使配制12年后仍有固定作用，待组织取材时则在Zenker干液100ml中加入5ml冰醋酸即可使用，但加入冰醋酸后必须立即使用，否则失去固定作用。特点：对细胞核、胞浆染色均较清晰，也较稳定，对肌组织及结缔组织染色效果好。材料厚度不超过2 mm 固定34小时即可，一般固定为1224小时。但必须经流水洗1224小时后再经酒精脱水。,2Carnoy固定液纯酒精（或者95）6份氯 仿 3份冰醋酸 1份优点：此液穿透
16、速度快，小块组织l2小时即可。此固定液可固定细胞浆及糖原。冰醋酸对染色质有固定作用，同时能抵消由于酒精引起的过度收缩与硬化。为了减少组织的收缩，可采用冷Carnoy液。Carnoy液随组织一起放置冰箱中固定一般固定时间以不超过1218小时为好。经此液固定的组织可直接入95或者100酒精脱水，现用现配为佳。它既可以用于一般组织学固定，可为组织化学常用固定剂，特别是用于糖原、DNA和RNA的固定。,组织固定方法,1.原位固定法在动物活体情况下，采用快速边取材边滴加固定液，取出标本后再浸泡固定30min-1h，这样有益于组织结构的保存，以上操作应在0-4下进行。2.浸透固定法预先冷藏固定液0-4，固
17、定液量应是样品40倍以上，浸泡30-90min或更长，应根据组织和固定液的不同而定。3.培养细胞和涂片固定法单层细胞培养瓶只需将培养内盖片取出浸透固定即可。悬液培养细胞应离心浓缩后涂片，或离心管内加入固定液2000r/min约20 min离心成团后制作切片。也可以向离心管内加入胶冻再离心，切取离心管尖端胶冻固定。,4.灌注固定法通过心血管途径将固定剂灌注到全身或某一器官，使生活的细胞在原位迅速固定后再取材，可达到非常好的固定效果，尤其对于脑等需要很长取材时间的器官更有意义。麻醉或颈椎脱臼处死动物后，立即打开胸腹腔和心包，滴溜注射针刺入左心室或主动脉内，剪开右心耳排血，立即用含有适量肝素的生理盐
18、水或缓冲液灌注，清洗血液；然后很快用固定液继续灌注，灌注量及灌注压应根据灌注血管不同而定，大小鼠心灌注时其压力约为100-150mmHg，灌流量约为5-10ml/min，灌注时间一般在5-20min左右，一般以观察动物肝质地变硬为准。灌注固定完成后（也可用缓冲液继续灌注清除固定剂）取材，并可用固定液后固定2小时。灌注固定快速均匀，可保存细胞组织的微细结构，但必须掌握操作技术才可能达到固定目的。,三、水洗,用水道流水洗涤，目的是将组织块中的固定液取代出来，水洗一定要充分。水洗时间数小时至24小时。根据材料多少、大小可灵活掌握水洗工具，可用水洗筐或用纱布包裹，要防止水流大将组织块冲掉或丢失。科研用
19、小材料也可用PBS液多次浸泡洗涤，但要保证至少4-6小时的洗涤时间。,四、脱水,组织块固定后虽然已经硬化，但达不到切薄片的硬度，必须进行除固定液以外的其它处理，脱水就是继固定后的重要步骤。经固定和水洗后的组织含大量水份，在这种情况下首先必须除去组织内部的水份，这种除水的过程叫做脱水，脱水使用的药剂称为脱水剂。脱水必须逐渐依次从低浓度酒精开始到高浓度酒精，否则会引起组织强烈收缩变脆，不利制片，但脱水不彻底也很难浸蜡。,常用脱水剂：酒精、丙酮、正丁醇等。1.酒精一股是从70酒精开始，经809095100I一100II，每步骤脱水时间根据材料大小而灵活掌握，一般数小时到12小时，更换一次酒精。无水乙
20、醇不适合用来配低浓度酒精，价格较贵。取95酒精70ml加蒸馏水25ml，配成70酒精95ml。80酒精取95酒精80ml加蒸馏水至95ml即可，依次类推。2.丙酮脱水作用与酒精相似，虽然其脱水作用比酒精强，但对组织块的收缩较严重，且价钱较贵，故不宜用于一股组织脱水。丙酮既有脱水作用，又有透明作用。用丙酮固定的材料要小，脱水1一8小时即可。,五、透明,组织块脱水后需要透明，因为水与蜡不能相交换，需要借助石蜡诱导剂的过渡。石蜡诱导剂渗入之后组织块往往呈现透明状态，习惯上将石蜡诱导剂渗入组织内的过程叫透明，而这种药剂称为透明剂。透明的时间依组织块的大小而定，一般采用20分钟至1小时左右，如组织块过大
21、可延长透明时间，透明好的材料如同油炸的感觉，呈透明状。,最常用的透明剂为二甲苯、氯仿、甲苯、香柏油等。二甲苯：是无色透明的一种有机溶媒，有很强的刺激气味，易挥发，长期接触对粘膜有刺激作用。二甲苯透明组织的作用很强，可使组织收缩变形，故透明时间不宜过长。透明过程中如遇到组织块内部或某一个部位呈白色混浊状态时，说明脱水不彻底，进而造成透明不彻底，无法下一步浸蜡。应退回到100酒精中重新彻底脱水。,六、浸蜡与包理,浸蜡的目的是为了能制备一菲薄的切片做准备。将透明好的组织块浸到石蜡中，使石蜡渗透到组织细胞内，将组织细胞内的二甲苯完全彻底地取代出来，然后再用石蜡将组织包埋起来，冷却后，切成小块，修整好切
22、面，再用切片机切极薄的切片，将这一过程称为浸蜡与包埋。,蜡的种类：主要有两类：蜂蜡：是动物体内提取的蜡，颜色微黄，故也称为黄蜡，溶点在54左右。特点是润滑带有粘性，冬天用量比夏天多。石蜡：是由矿物质中提取，质地较疏松，色白。根据蜡的溶点不同又可分为软蜡及硬蜡：溶点在50以下的石蜡称为软蜡。溶点在50以上的石蜡称为硬蜡。两种蜡可以掺合在一起使用（没条件的情况下可用蜡烛来代替）。上海生物制品厂出的石蜡熔点有5254，5658，5860，6062这几种。,具体操作：1.浸蜡将石蜡箱温调至5 860左右，内有标明I、II、III等字样的蜡杯或蜡缸。组织块从透明的二甲苯II取出之后，本身带有少量二甲苯，
23、放入I号蜡杯中23小时左右，再将组织块移入II号蜡杯（纯蜡）24小时，最后移入III号蜡杯中（纯蜡）半天或者稍降蜡箱温度过夜。注意：浸蜡时蜡杯不要颠倒顺序，以免脱苯不彻底。如遇特殊情况需要延长浸蜡时间时可降低蜡箱温度或关闭蜡箱需要时再开。温度越高、时间越长，组织块收缩越严重，而且材料脆，不易切片。,2.包埋：包埋的方法多种，最常用的是石蜡包埋法。除此之外还有火棉胶包埋法、炭蜡包埋法、明胶包埋法及环氧树脂包埋法（电镜用）。冰冻切片采用水包埋法或特殊专用包埋剂包埋等。包埋时用纯石蜡溶解后（60）倒入包埋框内或者用纸盒代替也可，迅速将浸好的组织块依次摆入框内，待蜡逐渐冷却凝固后就将组织材料一并凝结在
24、石蜡内。然后按大小组织块切成蜡块，组织四周蜡边留0.1厘米左右即可。包埋时组织块的切面向下、放平。如果操作不熟练或在冬天包埋时最好有一酒精灯，在材料包入石蜡之前稍在酒精灯上过一下（稍加一下温），以免材料与包埋蜡温度不符造成材料与包埋蜡有一痕迹，切片时产生分离现象。蜡块上要烫上标记年号例号等字样的纸片以长期保存，切完的蜡块表面要用烫片板烫一下，封闭材料面，隔离空气接触，可长期保存材料不干。目前主要用不同规格的包埋框包埋材料，在包埋机上操作，方便、快捷。,七、切片,载玻片的准备、粘附剂的使用：.商品化准备好的载玻片：两端带有“”标志，无须处理，直接使用；比较昂贵；.常规载玻皮的处理：铬硫酸浸泡24
25、小时，流水冲洗12小时，蒸馏水洗3遍，烘干，备用；玻片较干净时，也可用稀盐酸浸泡。蛋白甘油：用鸡蛋清（不要鸡蛋黄）用玻璃棒充分搅拌后用数层纱布过滤后加等量的甘油搅均匀加数颗麝香草酚（防腐）。载玻片上薄层涂抹后晾干，备用。主要用于常规组织学、组织化学染色用。,多聚赖氨酸（poly-L-lycine,PLL）多聚赖氨酸（M.W=300kD）0.5g 蒸馏水 100ml配制方法：称取多聚赖氨酸，配制0.5%的水溶液，充分混合即可。也可适当稀释配成0.01%-0.5%浓度。4保存，也可在-20备用。多聚赖氨酸可反复冰冻，效果无大影响。工作液常用稀释10-50倍。主要用于免疫组织化学、原位杂交、TUNE
26、L染色等。,APES粘片剂（Vectabong试剂）（3-Amino propyltriethoxy silane）是一种新型玻片粘附剂，通过对玻璃表面的化学修饰作用，改变其表面的化学物理特性，使组织切片牢固地粘贴于玻璃片上，贴上后不易脱落，保留时间较久。一个试剂盒7ml可配成350ml（丙酮）工作液。程序：干净载玻片丙酮5min APES(1ml+50ml丙酮），将玻片用镊子夹住浸入APES试剂1-2次纯丙酮洗2次干燥，37过夜用铝箔包好，RT存放，备用。铬矾明胶液（略）甲醛-明胶液（略）注意：备用载玻片均要避免污染（尤其注意防尘）；一般可保存半年以上。,制作切片需要的工具：切片刀、磨切机、
27、水浴锅、干燥箱或烤片机（可用蜡箱代替使用）。还需载玻片、手术刀、毛笔一支、弯镊子一个、托盘一个、大平皿一个、（展片使用）烤片盒或烤片架、蛋白甘油等。切片机：1.切片机种类：有轮转式切片机，滑行式切片机（滑动式），冰冻切片机，超薄切片机（电镜用）等；2.构造：任何一个类型的切片机都是由四个基本部分组成：刀台；标本台；旋转轮；控制切片厚度的微动装置（标有 l25或1一50的数字，每一数字代表一个微米用来显示）。可根据需要厚度来调节，一般组织片都采用7。以上四部分共装在一个铁制的台坐上，这样就组成了各种类型的切片机，最常用的是石蜡切片机。,切片操作：将切割修整好的蜡块用普通刀片先将蜡块切面暴露出来、
28、修平，固定在切片机标本台上并拧紧螺旋。切片刀固定于刀台上，拧紧固定刀的螺丝，同时调整刀与蜡块的切片距离，使刀与蜡块贴紧后再固定刀台螺丝，刀的角度为25度角。调节微动装置，调至切片所需厚度（一般为 6-7微米）修材。右手握旋转轮摇把，按顺时针方向均匀地摇动直到组织块切面完整为止。如果以上各部操作正常，此时能切出一条完整的连续的蜡带，用毛笔轻轻将蜡带顺刀口挑下，放在托盘内待用。,水浴锅展片、捞片通电后将平皿内水温升至45左右，将已切好的薄片切割数片轻漂水中展平，不平时可用小弯镊子轻轻展平，然后用涂有蛋白甘油等粘附剂的载片在水中选择完整的切片以一定角度进行捞片。注意事项：1切片刀要锋利，否则切片有切
29、痕或组织破碎，甚至切不下来。2展切片时水温要适当，水温低展不平切片，影响效果，有皱折；水温过高切片入水后蜡片及组织熔化。,八、染色,染色前准备工作染色用的工具：12个染色缸或者盛各种不同浓度的酒精染色筐广口瓶，染色缸及脱蜡、透明用的各二个二甲苯缸，盖片，带磨口盖的树胶瓶一个，镊子等。,染色需要的试剂及染色液的配制：盐酸酒精：主要是染色分色时用。一般采用0.51的浓度，即在100ml的7080酒精中加人0.5或者1ml的浓盐酸。苏木素（Hematoxylin）苏木素为细胞核的染料，不经氧化的苏木素是不具有染色能力的。苏木素的配方很多，一般组织化学染色所配制的苏木素有二类：一类是自然氧化的苏木素，
30、另一类是加入氧化剂加速氧化的苏木素。伊红（曙红，Eosin）是细胞质最常用的染料之一。外观是红色粉末。分两种，一种是酒溶性伊红，另一种为水溶性伊红。使用前要看说明以免配错。一般组织病理学切片染色，染细胞核用苏木素，染细胞质用伊红，故称之为HE染色（苏木素-伊红染色法），是诸多染色法的最基本染色法之一。,苏木素的配方：自然氧化Ehrlieh氏苏木素 苏木精 2g 铵明矾 3g 无水酒精 100ml 甘油 100ml 蒸馏水 100ml将上述药品配在一起后装入玻璃瓶中，敞口罩上数层纱布以防灰尘落入染液，暴露于阳光中或空气中自然氧化（此过程也称为成熟），时间约68周以上，染液配制越久其染色能力越强，
31、这种配方一次可以大量配制以备用。,Delafield氏苏木素 苏木素 4g 无水酒精 25ml 铵明矾饱和水溶液 400ml铵明矾饱和水溶液有两种配法，一为10铵明矾水溶液，另一为1份铵明矾加蒸馏水11份。苏木精溶入酒精后，加入铵明矾液，倒入玻璃瓶中敞开瓶口，罩以数层纱布，置光线充足处3至5天过滤。再加入甘油100ml、甲醇100ml，再置光线充足处经l个半月至两个月后成熟。此液可保存多年不坏。染色时多采用蒸馏水稀释的染色液。,加氧化剂的苏木素配方-Harris氏苏木素 液 苏木精 lg 无水酒精 10ml 液 钾（铵）明矾 20g 蒸馏水 200ml先将用玻璃棒搅拌使苏木素溶解，再将液煮沸溶
32、化去火，速加入液，再加火，煮沸后去火，立即加入氧化汞0.5g，再煮沸迅速冷却后加入冰醋酸8ml,过滤使用，此液为组织病理学常用染色液。,伊红染液的配制（Eosin）配法：0.5水溶性伊红取伊红0.5g加蒸馏水100ml即可，待彻底溶解后使用。0.5酒溶性伊红取伊红0.5g加70酒精100ml即可，待彻底溶解后使用。,染色方法及步骤（以HE染色为例）,1脱蜡，将干燥的切片入二甲苯I 10-20分钟，然后移入二甲苯 10-20分钟。2脱苯：用无水乙醇I 脱苯2-5分钟，再经无水乙醇II 2-5分钟。3水化：再经95908070酒精各1分钟，入蒸馏水浸洗数分钟，每步操作要轻。4染细胞核，将切片移入苏
33、木素染液中染10-20分钟。5水洗（水洗一下，将浮在表面的染液去掉）。6l盐酸酒精分化，时间几秒钟，肉眼观察切片组织材料呈粉红色即可。,7兰化：水道流水洗（半小时-24小时），切片从粉红色转变为鲜艳的兰色，这过程也称为兰化的过程。必要时放入氨水的低碱液中浸几分钟。8染细胞质：用0.5或者l伊红水溶液进行染色，1-5分钟。9切片脱水：是由低浓度酒精到高浓度酒精。将切片入70809095酒精，时间几秒钟，时间长了，伊红易脱色，注意伊红与苏木素的对比染色的色调适合。10彻底脱水，100酒精I 510分钟，再入100II酒精 510分钟。11.透明：入二甲苯I 25分钟，再入二甲苯II 25分钟。,用
34、中性树胶进行封固。细胞核经苏木素染成鲜艳的兰色，细胞质、核仁、肌纤维、胶原纤维、红细胞等呈红色。HE染色程序：二甲苯I二甲苯II（脱蜡）无水酒精I无水酒精II95908070水洗染苏木素（染细胞核）（10一20分钟）自来水洗1盐酸酒精分化自来水洗0.5伊红染色（染细胞质）直接脱水70809095（各稍停片刻）100I100II（为了脱彻底水）透明二甲苯I一二甲苯II 中性树胶封片。,九、封片与染色结果,封固剂,1.中性树胶2.DPX合成树胶（折光率1.52）3.液体石蜡4.甘油-TBS和甘油-PBS（水溶性）5.甘油-明胶（水溶性）染色切片可不经过脱水、透明直接用后两者封固剂封片、镜检，但干燥
35、后应使用指甲油封闭盖片边缘，以利于长期保存。,常规涂片染色：涂片的常规染色程序与切片染色程序一样，不同的是固定液不同，操作时间短。涂片自然干燥或者加温干燥后用甲醇固定。待固定液干燥后，直接染苏木素2-5分，水洗一下去浮色，1盐酸酒精分化（沾一下至二下即可），流水洗（5分钟以上）。染伊红2-5分钟，脱水70酒精809095各数秒，100I 100II各稍停片刻（为了脱彻底水），透明二甲苯I二甲苯II，中性树胶封片。,介绍两种常用的特殊染色方法Mallory氏染色法配方：酸性复红 3g 苯胺兰 1g 桔黄G 3g 磷钼酸 1g 蒸馏水 200ml,染色方法：1石蜡切片常规脱蜡至水。2入3重铬酸钾媒
36、染12-24小时，如果固定的材料含升汞可省此步骤，但需脱汞。3蒸馏水洗二次。4入Mallory染色液中染5分钟。5.蒸馏水洗。695酒精分化，约3-5分钟镜检下控制染色程度。7100I、100II酒精脱水。8二甲苯I、二甲苯II透明。9树胶封片。结果：胶原纤维及粘液呈深蓝色，红细胞呈红黄色，肌组织呈红色，弹力纤维呈玫瑰红色。,弹性纤维染色法（Weigert）盐基品红 2g 间苯二酚 4g 蒸馏水 200ml配制方法：将上述药品一起放入烧杯内，加热煮沸，再加29三氯化铁水溶液25ml、用玻璃棒搅匀，继续煮沸2-5分钟，冷却后过滤。倾去滤液不用。将滤纸及沉淀物一同放入烧杯内，放在干燥箱内烘干，取出加 95酒精200ml，加水煮至沉淀物尽溶，拿出滤纸冷却后过滤并补足蒸发失去的酒精，最后加入浓盐酸4ml即可，此液可保留数月。,染色方法：1切片脱蜡至酒精；2染Weigert氏液20-60分钟；3用95酒精洗去剩余染液，在显微镜下观察不清时可用1盐酸酒精分化；4自来水洗；5以l中性红作对比染色或用明矾苏木素染后，再用稀释伊红或用Van gieson液染色；6用95酒精分化，无水酒精脱水；7二甲苯工、透明；8树胶封片。结果：弹力纤维显示兰黑色。用中性红做对比染色，肌组织呈红色；用Van gieson液对比染色，肌组织呈黄色，胶原纤维呈鲜红色。,
