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1、中英联合实验室,1,第三章 蛋白质的提取与分离,中英联合实验室,2,3.1 蛋白质样品制备,中英联合实验室,3,目前，二维聚丙烯酰胺凝胶电泳依然是大多数蛋白质组研究中复杂蛋白混合物的核心技术。而选择合适的样品制备方法对获得满意的二维电泳图谱是十分重要的。对不同类型的蛋白进行样品制备时，需要采用不同的方法和条件。溶解的效果依靠选择的细胞破碎方法、蛋白解聚和溶解方法、去污剂和裂解液成分等来实现。,中英联合实验室,4,样品制备的原则,1.尽可能采用简单方法，以避免蛋白丢失；2.细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白质的降 解，低温和蛋白酶抑制剂可防止蛋白质的降解；3.样品裂解液应新鲜制备，并分装存于-
2、80。勿反 复冻融已制备好的样品；4.通过超速离心清除所有的杂质；5.加入尿素之后加温不要超过37，防止氨甲酰化 而修饰蛋白。,中英联合实验室,5,温和的裂解方法 用于组成比较简单的样品，或分析某一特定的细胞器。常用方法：（1）渗透裂解：血细胞、组织培养细胞（2）冻融裂解：细菌、组织培养细胞；液氮 冻融（3）去污剂裂解：用去污剂溶解细胞膜、裂 解细胞，释放内容物；用于组织细胞（4）酶裂解细胞：植物、细菌和真菌等含有 细胞壁的细胞,中英联合实验室,6,剧烈的蛋白裂解方法,常用于难于破碎的细胞，如固体组织内的细胞，或具有坚硬细胞壁的细胞，如酵母细胞。常用方法：（1）超声波裂解法：细胞样品（2）弗氏
3、压碎器：高压下迫使细胞穿过小孔径 而产生剪切力，从而裂解细胞；常用于 含有细胞壁的微生物、藻类（3）研磨法：常用于固体组织、微生物；冻存于 液氮中，随后研磨成粉末（4）机械匀浆法：（5）玻璃珠匀浆法：利用剧烈振荡的玻璃珠打破 细胞壁；用于细胞悬液或微生物,中英联合实验室,7,细胞裂解时，蛋白酶释放出来，会影响二维电泳的结果，因此需采取措施抑制蛋白酶的活性。常用策略：（1）直接加入强变性剂（2）低温、碱性条件下进行样品制备（3）使用蛋白酶抑制剂（PMSF、Protease inhibitor cocktail),蛋白酶抑制剂,中英联合实验室,8,蛋白沉淀方法,硫酸铵沉淀（盐析）TCA沉淀（三氯醋
4、酸沉淀）丙酮沉淀在丙酮中加TCA沉淀用苯酚提取，随后在甲醇中用醋酸铵沉淀,中英联合实验室,9,影响二维电泳图谱的杂质,1.盐离子、痕量缓冲液和其它带电荷的小分子-透析2.内源小分子（如核苷酸、代谢物和磷酸）-TCA/丙酮3.离子去污剂-丙酮or低温沉淀4.核酸（RNA、DNA）-DNase/RNase5.多糖-硫酸铵or苯酚/醋酸胺6.脂类-去污剂7.酚类组分-PVP8.不溶物质-离心,中英联合实验室,10,样品制备的分类,可溶性样品制备 如血清、血浆、尿样、脑脊液以及细胞和组织的水溶性提取物。组织样品制备细胞样品制备 体外悬浮培养生长的细胞或周期性细胞样品（如红细胞、淋巴细胞）样品分级 真核
5、生物组织蛋白质,中英联合实验室,11,可溶性样品制备,经过很少的前处理便可进行2-DE分析。蛋白浓度高的样品，如血清、血浆，可用适当样品溶解液稀释后直接分析；含有较低蛋白质浓度或较高盐浓度的样品，可通过透析或液相色谱脱盐，通过冻干、对聚乙二醇的透析或TCA/丙酮沉淀的方法进行浓缩。,中英联合实验室,12,组织样品制备,固体组织样品常在裂解液中破碎，最好的方法是将组织在液氮中冷冻破碎。组织样品存在样品异质性问题，通常采用基于免疫亲和技术的正、负性选择，以富集特殊的细胞群，裂解后可直接应用。目前，微量切割技术可以用来从组织样品中获取纯的细胞群，其中最受关注的是激光捕获微量切割技术（LCM）。,中英
6、联合实验室,13,细胞样品制备,细胞样品理想的方法是通过离心收集，随后用磷酸盐缓冲液清洗并溶于样品缓冲液。对于固体基质中培养的细胞，应先除去培养基质，用PBS或等渗蔗糖溶液清洗细胞层，然后再通过刮擦法收获细胞；或者加入体积裂解缓冲液，直接将基质上的细胞裂解。,中英联合实验室,14,样品预分级,（1）蛋白质溶解性进行分级（2）蛋白质在细胞中不同的细胞器定位进行 分级，如专门分离出细胞核、线粒体或 高尔基体等细胞器的蛋白质成分（亚细 胞分级）。样品预分级不仅可以提高低丰度蛋白质的上样量和检测，还可以针对某一细胞器的蛋白质组进行研究。,中英联合实验室,15,亚细胞器分离与蛋白质提取,亚细胞器的纯化和
7、分级可获得高度纯化和富集的蛋白依据密度差异进行细胞分级一般方法：低速离心分离出细胞核和未破碎细胞，得到上清夜。然后梯度离心分离各种细胞器。,中英联合实验室,16,Detergent Fractionation,Cells,Extraction withDigitonin/EDTA,CytoplasmicFraction,Extraction withTritonX100/EDTA,supernatent,pellet,Extraction withSDS/EDTA,OrganelleMembranes,Nuclear,Cytoskeletal(in SDS),中英联合实验室,17,中英联合实验
8、室,18,Subcellular Fractionation,Human mitochondrial proteins,Human nuclear proteins,中英联合实验室,19,实 例1.膜蛋白2.核蛋白,中英联合实验室,20,膜蛋白的提取与分离,膜蛋白指多肽链跨越脂双层数次的蛋白，被定义为膜整合蛋白或膜内在蛋白。膜内在蛋白的跨膜结构域必须折叠形成螺旋或片层的二级结构，膜蛋白处于细胞边界，在细胞的各种生命活动中发挥重要作用。,中英联合实验室,21,膜蛋白提取中有两点需要注意,（1）膜蛋白的纯度如何？（2）膜蛋白很难出现在二维凝胶图谱中,中英联合实验室,22,细胞在水相、去污剂中进行裂
9、解时，细胞膜和内膜网络将会断裂成碎片或颗粒，通过沉淀或分级技术加以分离。但这些技术也能分离膜连的细胞器。两种广泛应用的技术可最低限度地减少样品制备的污染：（1）应用盐，主要是溴化钾，或更多的离液剂进行 清 洗，使与膜相互作用较弱的蛋白分离；（2）应用去污剂分级除去膜样品制备中的可溶性杂 杂质。,中英联合实验室,23,膜蛋白是低丰度的、多为偏碱性、难溶于等电聚焦的水相介质中的蛋白，很难出现在二维凝胶图谱中。为了能够在二维凝胶图谱中，首先必须实现3个条件：（1）保持膜的脂类环境；（2）以可溶形式（去污剂蛋白复合物）从膜上 分离出来；（3）所提取的膜蛋白必须维持可溶状态。,中英联合实验室,24,以上
10、条件限制了用二维电泳分析膜蛋白，但是现代技术的发展是可以解决这种限制的。例如：新的、宽范围的pH预制干胶条的出现、制备型电泳都可以使之变得容易解决。新的去污剂、离液剂、还原剂以及有机试剂等能够溶解膜内在蛋白。,中英联合实验室,25,中英联合实验室,26,核蛋白的提取与分离,许多细胞核蛋白属于中等溶解度的，所以联合尿素、硫脲和去污剂裂解核蛋白，可达到足够的分辨率。核基质是Bereaney和Coffey在1974年提出的概念，指非染色质结构蛋白及核表面经高盐离子、核酸酶、去污剂抽提后所剩的核蛋白网状结构。,中英联合实验室,27,核基质包括核表面核纤层蛋白、多种低丰度核蛋白、核内不均一核糖核蛋白以及
11、基质相关的DNA结合区。核基质蛋白的提取通常采用Fey和Penman建立的方法。,中英联合实验室,28,细胞液,缓冲液（0.5Triton X-100、1.2mol/L蛋白酶抑制剂）,离心,沉淀,提取液415min,离心,沉淀,消化液室温30min,离心,沉淀（核基质蛋白和中间丝）,溶于8mol/L尿素的蛋白裂解液,透析除去尿素,超速离心,上清液,核蛋白的提取,中英联合实验室,29,核膜含有几个富集在不同组分的膜整合蛋 白和多蛋白复合物，而且许多膜整合蛋白 与结构蛋白的相互作用网络不能通过去污 剂提取。因此，通常会采用不同的提取策 略来完成核膜蛋白的分级制备。,中英联合实验室,30,(己烯乙二
12、醇),(一种包有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒),Arabidopsis seedling,Homogenizes,1M Hexylene glycol0.5 M PIPES(pH7)10mM MgCl2,Pass two miracloth,Add 1%TritonX-100,Percoll density gradient Centrifuge(35%/80%),Collect interface nuclear fraction,Wash&Centrifuge,Dissolve nuclear protein inLysis buffer,中英联合实验室,31,综上所述，随着人类和众多模式生物基
13、因组测序的结束，蛋白质组的研究将会达到一个新的高度。寻找更好的方法进行样品制备和蛋白质提 取，为深入进行蛋白质组研究奠定基础。,中英联合实验室,32,3.2 蛋白质分离技术,中英联合实验室,33,理想分离方法的要求：,1）具备超高分辨率 2）能有效分离不同类型的蛋白质,中英联合实验室,34,目前常用的分离技术,1）凝胶电泳技术 1D Gel Electrophoresis 2D Gel Electrophoresis Capillary Electrophoresis2）色谱技术 HPLC MudPIT,中英联合实验室,35,聚丙烯酰胺凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide
14、 gel electropho-resis，PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳方法。聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好，有弹性，透明，化学性质稳定，对pH和温度变化小，没有吸附和电渗作用小的特点，是一种很好的电泳支持介质。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（acrylamide，简称Acr）和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺（methylane bisacrylamide，简称Bis）在催化剂作用下合成的。,中英联合实验室,36,CH2=CH,C=O,NH2,CH2=CH,C=O NH CH2 NH C=O CH2=CH,-CH2-CH-CH2-CH-nCH2-CH-C=O C=O NH2
15、NH CH2 NH C=O-CH2-CH-CH2-CH-nCH2-CH-C=O C=O NH NH2,丙烯酰胺,聚丙烯酰胺,N,N-甲叉双丙烯酰胺,中英联合实验室,37,凝胶配制时的两个重要参数,T=,a+b,m,100%,C=,a+b,b,100%,（5-30%）,（3%）,中英联合实验室,38,二维凝胶电泳,二维凝胶电泳又称双向凝胶电泳（twodimensional gel electrophoresis，2-DE）,是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离与展示的分离技术。,Simultaneous separation and detection of 2000 proteins on a
16、20 x25 cm gelUp to 10,000 proteins can be seen using optimized protocols,中英联合实验室,39,Why 2D GE?,Oldest method for large scale protein separation(since 1975)Still most popular method for protein display and quantificationPermits simultaneous detection,display,purification,identification,quantification
17、Simple,cost effective,scalable¶llelizable,increasingly reproducible,Provides pI,MW,quantity,中英联合实验室,40,Steps in 2D GE,中英联合实验室,41,蛋白质双向电泳,第二向电泳,第一向电泳,中英联合实验室,42,基 本 原 理：,第一相是根据不同蛋白质所带电荷量的特性，利用等电聚焦(isoelectric focusing，IEF)蛋白质沿pH梯度分离，至各自的等电点第一相等电聚焦电泳系统内含有高浓度的脲和非 离子型去垢剂NP-40或兼性离子去污剂CHAPS，而且溶解蛋白质样品的
18、溶液除含有脲和NP-40(CHAPS)外，还含有二硫苏糖醇其作用使蛋白质分子内部的二硫键破坏，达到充分变性这些试剂不带有电荷，不会影响蛋白质的原有电 荷和等电点。,中英联合实验室,43,IEF Principles,中英联合实验室,44,Isoelectric Focusing,Separation of basis of pI,not MWRequires very high voltages(5000V)Requires a long period of time(10h)Presence of a pH gradient is criticalDegree of resolution d
19、etermined by slope of pH gradient and electric field strength,中英联合实验室,45,Ampholytes vs.IPG,Ampholytes are small,soluble,organic molecules with high buffering capacity near their pI(not characterized)Used to create pH gradients via userGradients not stableBatch-to-batch variation is problematic,An im
20、mobilized pH gradient(IPG)is made by covalently integrating acrylamido buffer molecules into acrylamide matrix at time of gel castingStable gradientsPre-made(at factory)Simplified handling,中英联合实验室,46,IPG Strips,Strip Length7.9 cm11.8 cm17.8 cmGel Length7.3 cm 11.0 cm17.1 cmStrip Width3.3 mm3.3 mm3.3
21、 mmGel Thickness0.5 mm0.5 mm0.5 mmpH GradientsStandard3-10,4-73-10,4-73-10,4-7Overlapping3-6,5-83-6,5-83-6,5-8,R=weakly acidic or basic buffering group,Acrylamido buffer,中英联合实验室,47,Narrow-Range IPG Strips,pH 4 pH 9,中英联合实验室,48,Rehydrate IPGstrip&applyprotein sample,Place IPG stripin IEF apparatusand
22、apply current,中英联合实验室,49,第一相等电聚焦电泳结束后带有蛋白质的凝胶从玻璃管中脱出后（可置于零下80度保存），必须经过第二相SDS电泳分离系统的溶液平衡。所用平衡液为含有疏基乙醇和SDS的第二相浓缩胶缓冲液巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键保持还原状态，有利于SDS与蛋白质的充分结合。一般振荡平衡30分钟，使等电聚焦凝胶中的两性电解质和高浓度的脲扩散出胶，使等电聚焦凝胶为第二相浓缩胶缓冲液所平衡。,中英联合实验室,50,第二相是根据不同蛋白质分子量大小的特性，通过蛋白质与SDS形成复合物后，在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的不同分子大小迁移达到分离蛋白质的目的(SDS-PAGE)，把
23、复杂的蛋白质混合物中的蛋白在二维平面上分离展开。,中英联合实验室,51,SDS是一种阴离子去垢剂，和蛋白质的疏水部位结合，它能破坏蛋白质分子间的共价键，使蛋白质变性而改变原有的构象。在蛋白溶液中加入过量的SDS后，可以引起以下的反应：蛋白质本身的电荷变化被屏蔽 氢键被断裂 疏水相互作用被取消 形成椭球形。,中英联合实验室,52,在强还原剂巯基乙醇（或是二硫苏糖醇）存在的情况下，由于蛋白质分子内的二硫键已被还原打开不易再氧化，这就保证了蛋白质分子与SDS充分结合，从而形成带负电荷的蛋白质SDS复合物。,中英联合实验室,53,实验证明，当SDS单体浓度大于1mmol/L对于多数蛋白质来说，平均每克
24、蛋白质可结合1.4g SDS。蛋白质分子与SDS结合的复合物，所带的SDS负电荷大大超过了蛋白质分子原有带电量，掩盖了不同种类蛋白质分子之间原有电荷差异。,中英联合实验室,54,蛋白质SDS复合物的流体力学和光学性质表明，它在水溶液中的形状类似于长椭圆棒，不同蛋白质SDS复合物，其椭圆棒的短轴长度是恒定的，约为18A；长轴的长度与蛋白质的分子量大小成比例地变化 蛋白质SDS复合物在SDS聚丙烯酰胺凝胶系统中的电泳迁移率便不再是蛋白质原有电荷和形状等因素的影响，而主要取决于椭圆棒长度即分子量大小这一因素。,中英联合实验室,55,SDS PAGE Tools,中英联合实验室,56,SDS-PAGE
25、 Principles,Loading Gel,Running Gel,中英联合实验室,57,Mobility&Acrylamide%,200,200,200,200,45,45,45,45,45,6.5,200,中英联合实验室,58,丙烯酰胺在凝胶中的百分比 分离胶的分辨范围 15%15-45 kDa 12.5%15-65kDa 10%18-75kDa 7.5%30-120kDa 5%60-212kDa,中英联合实验室,59,胶上蛋白的检测,双向凝胶电泳分离后的蛋白质需要经过染色处理才能进行检测。目前常用的染色方法有：（1）考马斯亮蓝染色（2）银染（3）负染（4）荧光染色（5）放射自显影,中
26、英联合实验室,60,不同染色方法的性能一览表,中英联合实验室,61,考马斯亮蓝染色,中英联合实验室,62,考马斯亮蓝染色程序1)固定：50乙醇10冰醋酸的水溶液，至少30 min,可过夜；2)染色：染色液为45甲醇10冰醋酸0.25考马 斯亮监G250溶液过滤所得，将凝胶染色2h左右；3)脱色：多次更换脱色液(25乙醇8冰醋酸水溶液)直至背景脱净，为了加快脱色可略加温度；4)保存：脱色后凝胶经水洗后扫描备份，用保鲜膜包裹即 可，通常在一个月内均可进行质谱鉴定，若需保存时间 长，可先把需鉴定蛋白质点切下进步脱色后与-80 冰箱保存。,中英联合实验室,63,传统的蛋白质染色方法，可以检测到3010
27、0ng蛋白质，其灵敏度较低。其优点是染色过程简单，所需配制的试剂少，操作简便，无毒性，染色后的背景及对比良好，与下游的蛋白质鉴定方法兼容。胶体考马斯亮蓝检测蛋白质的极限是810ng。,中英联合实验室,64,PAGE胶经G250胶体考马斯亮蓝染色后可以获得无背景或很低的背景；估计是因为在胶体染料和溶液中的自由扩散染料间形成平衡，溶液的少量自由染料穿透凝胶基质，有选择地对蛋白质染色，而胶体态的染料排阻在胶外，阻止了背景生成。,中英联合实验室,65,银 染,中英联合实验室,66,银染是非放射性染色方法中灵敏度最高 的，其灵敏度可达200pg。银染成本较低，是目前仍然是差异蛋白 质组分析中最常用的显色
28、方法。,中英联合实验室,67,经典银染方法是将二维电泳凝胶在固定液中固定后，在含戊二醛的溶液中增敏，然后在AgNO3溶液中浸泡，蛋白与Ag结合，凝胶空白背景中的Ag由于结合不牢而被洗去，而含蛋白质的区域则由于蛋白质中自由氨基与Ag的相互作用而未被洗去，随后在碱性环境中，甲醛溶液将结合在蛋白带上的Ag还原为金属银，银颗粒沉积使蛋白质显示棕黄色或棕黑色。,中英联合实验室,68,银染可分酸性（AgNO3染色）和碱性（氨银法）两种。酸性染色背景浅，容易控制，所以用的较多，方法多种多样；碱性染色则灵敏度稍高，但背景深，难以控制。,中英联合实验室,69,中英联合实验室,70,传统银染方法的缺陷,银染法线性
29、关系差；由于使用增感戊二醛和温浴阶段使用甲醛，使得蛋白质spot 很难洗脱；解决办法？（1）戊二醛和温浴阶段使用甲醛（2）采用硫代硫酸钠和铁氰化钾脱色（铁氰化钾使银氧化为亚铁氰化银，后者可与硫 代硫酸钠结合，形成水溶性复合物）,中英联合实验室,71,负 染,Staining with colloidal Coomassie brilliant blue G-250,Negative staining with imidazole-zinc,中英联合实验室,72,标准考染方法所存在的一个缺点是染色步骤中含蛋白质固定过程，银染法除固定过程外，还有增敏步骤，这些会将蛋白质提取至胶外，从而减少蛋白产量
30、，使得后续微量化学表征的样品量更少。负染的方法则提高了PAGE胶上蛋白质的回收率。其灵敏度稍高于考染，可达到50ng以下。,中英联合实验室,73,常用的负染方法有铜染、锌咪唑等。负染结果在凝胶表面会产生半透明背景，其中蛋白质以透明的形式被检测出来。凝胶显示黑色背景或相应的底色。负染的染色过程很快，约需515min即可完成，而且蛋白质的生物活性可以得到保持。,中英联合实验室,74,荧 光 染 色,荧光试剂显色对蛋白质没有固定作用，与 质谱兼容性好，而其灵敏度与银染相仿，但线性范围要高于银染。荧光染色技术更适用于比较蛋白质组学的 研究。,中英联合实验室,75,SYPRO Ruby是最近很受关注的另
31、外一种荧光染料，它是专利的基于钌的金属鳌合染料。SYPRO Ruby 2-DE和IEF染色仅需一步即可获得PAGE内蛋白质的低背景染色，而且不需要进行长时间脱色步骤，在性能上超过了银染和考马斯亮蓝染色，且灵敏度比银染高330倍。,中英联合实验室,76,荧 光 染 色,FLA-5000-image:Sypro Ruby stained 2 D-gel,brain proteins,中英联合实验室,77,最近较新的应用是利用丙基Cy3和甲基Cy5两种染料分别对两种不同蛋白质样品进行荧光标记，并在一块2-D胶上同步进行。两种修饰后染料的激发波长不同，这样在同一快可以用两个波长范围进行扫描，得到的图像
32、经软件匹配即可方便找出两个样品的差异。由于在同一块胶上运行，避免了实验因素对重复性的影响。,中英联合实验室,78,荧 光 标 记,Cy3/Cy5-labeled 2-DE differential display,中英联合实验室,79,Trouble Shooting 2D GE,Horizontal streaksSample not completely solubilized prior to application on IPG,sample poorly soluble in rehydration solution,ionic impurities,ionic detergents
33、,Vertical streaksInsufficient equilibration,insufficient SDS,中英联合实验室,80,双向电泳的局限性,(1)SDS等去污剂对蛋白质的变性作用是不可逆的。(2)疏水性蛋白质因不能溶于SDS而不适合作2-DE；PI值11的蛋白质；分子量过大或过小的蛋 白质；低丰度蛋白质1ng，都很难被检测到。(3)样品上样量相对少，使检测的灵敏度受到限制。(4)电泳结果需经染色处理，不能直接分析，不同蛋 白质与染料的结合差异较大。(5)不能高通量分析，且耗时。(6)目前尚不能实现完全自动化处理。,中英联合实验室,81,Conclusions,2D gel
34、 electrophoresis is still the most popular and powerful method for protein display,separation,visualization and quantitationOffers good to excellent sensitivity and is now very reproducible2D GE is still essential for proteomicsRunning and analyzing 2D gels requires skill,patience and good software,
