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1、第三章表面等离子体共振技术,目 录,3-1 表面等离子体共振（SPR）的产生3-1-1 SPR简史3-1-2 金属内部的等离子体振动3-1-3 金属表面的等离子体振动3-1-4 产生表面等离子体共振的方法3-2 SPR传感器的基本概念3-2-1 传感器的基本原理3-2-2 传感器的基本结构3-3 典型的SPR传感器及其应用,3-1-1 SPR简史,1902年，Wood在光学实验中发现SPR现象1941年，Fano解释了SPR现象1971年，Kretschmann结构为SPR传感器奠定了基础1982年，Lundstrm将SPR用于气体的传感（第一次）1983年，liedberg将SPR用于IgG
2、与其抗原的反应测定1987年，Knoll等人开始SPR成像研究1990年，Biacore AB公司开发出首台商品化SPR仪器,表面等离子体共振（Surface plasmon resonance，SPR），又称表面等离子体子共振，表面等离激元共振，是一种物理光学现象，有关仪器和应用技术已经成为物理学、化学和生物学研究的重要工具，。,在金属中，价电子为整个晶体所共有，形成所谓费米电子气。价电子可在晶体中移动，而金属离子则被束缚于晶格位置上，但总的电子密度和离子密度是相同的，从整体来说金属是电中性的。人们把这种情况形象地称为“金属离子浸没于电子的海洋中”。这种情况和气体放电中的等离子体相似，因此可
3、以把金属看作是一种电荷密度很高的低温（室温）等离子体，而气体放电中的等离子体是一种高温等离子体，电荷密度比金属中的低。,金属板中电子气的位移,（上）金属离子（+）位于“电子海洋”中（灰色背景），（下）电子集体向右移动,五十年代，为了解快速电子穿过金属箔时的能量损失，人们进行了大量的实验和理论工作。Pine和Bohm认为，其中能量损失的部分原因是激发了金属箔中电子的等离子体振动（Plasma oscillation），又称为等离子体子（plasmon）。Ritchie从理论上探讨了无限大纯净金属箔中由于等离子体振动而导致的电子能量损失，同时也考虑了有限大金属箔的情况，指出：不仅等离子体内部存在角
4、频率为p的等离子体振动，而且在等离子体和真空的界面，还存在表面等离子体振动（Surface plasma oscillation），其角频率为。Powell和Swan 用高能电子发射法测定了金属铝的特征电子能量损失，其实验结果可用Ritchie的理论来解释。Stern和Ferrell将表面等离子体振动的量子称为表面等离子体子（Surface plasmon），研究了金属表面有覆盖物时的表面等离子体振动，发现金属表面很薄的氧化物层也会引起这种振动的明显改变。他们还预言：由于表面等离子体振动对表面涂层的敏感，那么通过选择合适的涂层，表面特征能量损失的值会在一定范围内发生变化。,除电子以外，用电磁波
5、，如光波，也能激发表面等离子体振动。二十世纪初，Wood 首次描述了衍射光栅的反常衍射现象，这实际上就是由于光波激发了表面等离子体振动所致。六十年代晚期，Kretschmann 和Otto采用棱镜耦合的全内反射方法，实现了用光波激发表面等离子体振动，为SPR技术的应用起了巨大的推动作用。他们的实验方法简单而巧妙，仍然是目前SPR装置上应用最为广泛的技术。,(A)Kretschman(B)Otto,3-1-2 金属内部的等离子体振动,因为金属中的价电子可以自由移动，入射光可能激起电子气的纵向振动。如果由于入射电子的作用，金属中电子向右移动了一段距离，因此在右边就有了电子堆积。设ne为电子密度，右
6、边出现的面电荷密度为-nee，左边的面电荷密度为+nee，则金属的极化强度p为：由极化产生的电场Ep为:在这个电场的作用下，电子有向左移的倾向，于是产生了振动。如果不考虑振动能量的衰减，单位体积内的电子气的振动方程式为：式中m为电子的质量，e为电子的电荷量，p为无衰减时的等离子体振动的角频率，则,或,等离子体子（plasmon，又称等离激元）的量子能量为：对金属来说，ne1023/cm3，将此值代入式（5-6），可得金属中等离子体子的量子能量约为：如果考虑了金属内电子的衰减，弛豫时间为，在外电场的存在下，电子只沿z方向运动，则电子的运动方程（Drude方程）为：,由此可得：代入，则复数介电常数
7、若忽略衰减，即 时，有：根据等离子体理论，产生固体等离子体波应满足,3-1-3 金属表面的等离子体振动,上节所述的是金属内部的等离子体振动，即体积等离子体振动（Volume plasma oscillation）。而在金属表面也存在电荷密度振动，称为表面等离子体振动，其角频率s与体积等离子体的不同，它们之间存在以下关系：若金属表面覆盖有介电常数为的薄层，则这种特殊表面的等离子体振动的角频率ms为：,3-1-4 产生表面等离子体共振的方法,表面等离子体振动产生的电荷密度波，沿着金属和电介质的界面传播，形成表面等离子体波（Surface plasma wave，SPW），其场矢量在界面处达到最大，
8、并在两种介质中逐渐衰减。表面等离子体波是TM极化波，即横波，其磁场矢量与传播方向垂直，与界面平行，而电场矢量则垂直于界面。在半无穷电介质和金属界面处，角频率为的表面等离子体波的波矢量为：式中c是真空中的光速，m和a分别是金属和电介质的介电常数。表面等离子体波的波矢量是复数，因为金属的介电常数是复数（m=mr+imi）。金属的mr/mi比高，波矢量的实部分可近似为：,电磁波在真空中的速度c与在不导电的均匀介质中的速度v之比称为电介质的折射率n：在光波的频率下，电介质一般为非磁性的，1，有：则：频率为的通过电介质传递的光的波矢量ka为：,要使光波和表面等离子体波之间发生共振，必须有：,但是，电介质
9、中光的（ka）总是在（kspw）的左边，从不交叉，即（kspw）（ka）。因此，电介质中的光不能直接激发表面等离子体子共振（SPR），必须要设法移动（kspw）或（ka）的色散曲线的位置，使两者相交。可利用光学耦合器件，如棱镜、光栅以及光学波导器件达到这一目的。,棱镜耦合,棱镜是SPR研究中应用最为广泛的光学耦合器件。棱镜由高折射率的非吸收性的光学材料构成，其底部镀有厚度为50nm左右的高反射率的金属薄膜（一般为金或银），膜下面是电介质。在SPR传感器中，该电介质即为待测样品。由光源发出的p-偏振光以一定的角度0入射到棱镜中，在棱镜与金属的界面处将发生反射和折射。当0大于临界角c时，光线将发生
10、全内反射，即全部返回到棱镜中，然后，从棱镜的另一个侧面折射出去。这里入射光应当用p-偏振光，因为其电场分量与界面垂直，这与表面等离子体波的情况一致。,在全内反射的情况下，电场在金属与棱镜的界面处并不立即消失，而是向金属介质中传输振幅呈指数衰减的消失波。该消失波沿X轴方向传播的与表面平行的波矢分量kev为：通过调节0 或a，可使kev=kspw，消失波与表面等离子体波共振，即表面等离子体子共振，有：由上式可见，若入射光的波长一定，即a一定时，ns改变，则必须改变0以满足共振条件；若0一定时，ns改变，则必须改变a以满足共振条件，这可通过改变入射光的波长来实现。此时0和分别称为共振角和共振波长。,
11、典型的SPR光谱,目 录,3-1 表面等离子体共振（SPR）的产生3-1-1 SPR简史3-1-2 金属内部的等离子体振动3-1-3 金属表面的等离子体振动3-1-4 产生表面等离子体共振的方法3-2 SPR传感器的基本概念3-2-1 传感器的基本原理3-2-2 传感器的基本结构3-3 典型的SPR传感器及其应用,3-2-1 传感器的基本原理,表面等离子体子共振的产生与入射光的角度、波长、金属薄膜的介电常数s及电介质的折射率ns有关，发生共振时和分别称为共振角度和共振波长。对于同一种金属薄膜，如果固定，则与ns有关；固定，则与ns有关。如果将电介质换成待测样品，测出共振时的或，就可以得到样品的
12、介电常数s或折射率ns；如果样品的化学或生物性质发生变化，引起ns的改变，则或也会发生变化，这样，检测这一变化就可获得样品性质的变化。固定入射光的波长，改变入射角，可得到角度随反射率变化的SPR光谱；同样地，固定入射光的角度，改变波长，可得到波长随反射率变化的SPR光谱。SPR光谱的改变反映了体系性质的变化。,3-2-2 传感器的基本结构,一般来说，一个SPR传感器的包括：光学系统、敏感元件、数据采集和处理系统。SPR传感器的光学部分包含光源、光学耦合器件、角度（或波长）调节部件以及光检测器件，用于产生SPR并检测SPR光谱的变化。敏感元件主要指金属薄膜及其表面修饰的敏感物质，用于将待测对象的
13、化学或生物信息转换成折射率的变化，是SPR传感器的关键。从SPR的原理可知，实际上是样品的折射率的变化引起SPR光谱的变化。如果金属薄膜未经任何修饰，这样的传感器是没有什么选择性的，只能用于一些简单体系的测定，因而一般都要进行修饰，以获得对被测对象的选择性识别能力。数据采集和处理系统用于采集和处理光检测器产生的电子信号。现在光检测器越来越多地采用阵列检测器，如光电二极管阵列和电荷耦合器件，以便同时检测多个角度或波长处的信号变化。数据采集和处理均由计算机完成。,4种检测方式,角度调制：固定in，改变in波长调制：固定in，改变in强度调制：固定in、in，改变光强相位调制：固定in、in，测相差
14、,一个SPR传感器的主要性能特点，如灵敏度、稳定性、分辨率、选择性和响应时间等，取决于其各个组成部分的性能。SPR传感器使用时，一般是先在金属薄膜表面修饰一层敏感物质，以便与样品中的待测组分选择性地作用。这一相互作用会引起敏感层折射率的改变，导致SPR信号的变化，从而获得待测样品的化学或生物信息。如果不对金属薄膜进行修饰，这样的传感器也可用于一些简单体系的检测，如一些浓度随折射率变化的溶液（乙醇、蔗糖、葡萄糖等的水溶液）。金和银相对来说比较稳定，且反射率高，是比较常用的两种金属。在生物体系的测量中，常常有氯离子存在，用银膜不太合适，一般都用金膜。,目 录,3-1 表面等离子体共振（SPR）的产
15、生3-1-1 SPR简史3-1-2 金属内部的等离子体振动3-1-3 金属表面的等离子体振动3-1-4 产生表面等离子体共振的方法3-2 SPR传感器的基本概念3-2-1 传感器的基本原理3-2-2 传感器的基本结构3-3 典型的SPR传感器及其应用,L：卤钨灯；C：平行光管；P：偏振片；D：光阑；G：光栅；B：玻片,基于波长调制的SPR传感器装置,葡萄糖溶液的测定,SPR光谱（葡萄糖，银膜）,响应曲线（葡萄糖，银膜）,裸金属膜对其表面溶液的折射率变化非常敏感，可用于一些简单样品的分析，此处用SPR传感器测定了医用葡萄糖注射液的浓度。该法所得结果与药典法相符，可用于葡萄糖注射液生产过程的实时在
16、线监测。,乙肝表面抗原（HBsAg）的测定,病毒性肝炎是人群中最常见的传染性疾病之一，对人体健康危害很大。我国是乙型肝炎的高发区，人群总感染率高达60%，乙型肝炎表面抗原（HBsAg）携带者至少有1.2亿，其中约10%最终转化为各种慢性肝病，包括慢性肝炎、肝硬化甚至肝癌。作为乙型肝炎的早期诊断指标之一，HBsAg的测定在临床上具有重要意义。目前用到的临床检验方法有：血细胞凝集法（PHA、RPHA）、酶联免疫法（EIA、ELISA）、放射免疫法（RIA）、全血凝集法、斑点杂交法、聚合酶链反应法（PCR）等等，其中放射免疫法较为灵敏，可检出血清中0.1ng/mL的HBsAg，但存在放射性污染的问题
17、。酶联免疫吸附法（ELISA）由于简单、方便、快速，目前是临床诊断中最常用的，其检出限一般为1ng/mL HBsAg。如果能进一步提高灵敏度，对及早发现、诊断和治疗乙型肝炎无疑具有非常重要的意义。,利用胱胺将HBsAg单克隆抗体固定于金膜表面,以A蛋白为连接层固定HBsAg单克隆抗体M：金膜，G：玻片，Ag：血清中的HBsAg，Ab：HBsAg单克隆抗体，PA：A蛋白,胱胺固定法中HBsAg与抗体结合前后的SPR光谱图,检测限为0.01ng/mL,固定化DNA单层的电致开关行为研究,固定化DNA探针的取向直接影响到固液两相之间的DNA杂交。固定化DNA易于被电场驱动远离或靠近固体表面，构成一种
18、纳米尺度上的“开关”。SPR传感技术是一种对金属薄膜表面介质层的折射率变化极为敏感的光学传感技术,非常适合于研究固定化单分子层的性质。然而，如果在SPR传感器中使用经典的三电极体系施加电场，对金膜本身的SPR光谱有较大影响。,Knoll et al.Langmuir 2005,21:348-353,L：卤钨灯；C：平行光管；P：偏振片；D：光阑；G：光栅；E：直流电源；B：ITO导电玻璃,（A）金膜不带电荷；（B）金膜带负电荷；（C）金膜带正电荷.,A B C,金膜表面固定化DNA探针的取向,电场对金膜表面固定化DNA探针的作用,（a）金膜带正电荷；（b）断开电路；（c）金膜带负电荷；（d）断
19、开电路.,不同强度的电场对DNA探针的作用,电场在-1.5V与1.5 V间切换,（1）金膜带负电荷；（2）金膜带正电荷,（1）金膜带负电荷；（2）金膜不带电荷；（3）金膜带正电荷.,不同强度的电场对固定化DNA探针捕获cDNA的影响,电场对不同浓度cDNA杂交的影响,E=1.5V,CDNA=2.83 nM,电场对DNA杂交的作用,表面覆盖率的影响,电场（金膜与ITO导电玻璃之间电位差为1.5 V）对不同表面覆盖率的DNA探针的作用,5.87 1012,电场（金膜与ITO导电玻璃之间的电位差为1.5 V）对不同表面覆盖率的DNA杂交的影响，cDNA浓度为5.65 nmol/L,基于SiO2包被金
20、膜的纳米金颗粒催化增长增强SPR传感器及其DNA检测应用,(Biosens.Bioelectron.2007,22,1106-1110),(a)生物素化的DNA探针；(b)目标DNA；(c)巯基DNA修饰的纳米金颗粒；(d)纳米金颗粒催化增长.,SiO2包被金膜的纳米金颗粒催化增长增强SPR传感检测DNA原理示意图,SiO2层对金沉积的阻挡作用,金膜 SiO2包被的金膜,（1）与催化增长试剂反应前；（2）与催化增长试剂反应后,SPR传感器:(a)cDNA,(a)单碱基错配DNA,(a)随机DNA；纳米金颗粒增强SPR传感器:(b)cDNA,(b)单碱基错配DNA,(b)随机DNA；纳米金颗粒催
21、化增长增强SPR传感器:(c)cDNA,(c)单碱基错配DNA,(c)随机DNA.,不同方法检测DNA的比较,(a)cDNA；(b)单碱基错配DNA；(c)随机DNA；三种传感器分别为(I)纳米金颗粒催化增长增强SPR传感器；(II)纳米金颗粒增强SPR传感器；(III)SPR传感器.,CDNA=3.3nM,Sensors&Actuators 2007,123,227-232.,(a)金膜；(b)聚电解质自组装多层膜(PAH/PSS)3；(c)亲和素；(d)生物素化的DNA探针；(e)目标DNA；(f)巯基DNA修饰的纳米金颗粒；(g)纳米金颗粒催化增长.,基于聚电解质自组装多层膜修饰金膜的纳
22、米金颗粒催化增长增强SPR传感器及其DNA检测应用,聚电解质自组装薄膜对金属沉积的阻挡作用,不同层数的(PAH/PSS)修饰的金膜对金属沉积的阻挡作用,SPR传感器:(a)cDNA,(a)单碱基错配DNA,(a)随机DNA；纳米金颗粒增强SPR传感器:(b)cDNA,(b)单碱基错配DNA,(b)随机DNA；纳米金颗粒催化增长增强SPR传感器:(c)cDNA,(c)单碱基错配DNA,(c)随机DNA.,(a)cDNA；(b)单碱基错配DNA；(c)随机DNA；三种传感器分别为(I)纳米金颗粒催化增长增强SPR传感器；(II)纳米金颗粒增强SPR传感器；(III)SPR传感器.,CDNA=3.3
23、nM,不同方法检测DNA的比较,（1）氨基修饰的DNA探针固定在金膜表面后的SPR光谱；（2）与33 nmol/L cDNA杂交之后的SPR光谱；（3）再与纳米金颗粒标记的巯基DNA反应之后的SPR光谱；（4）在Au膜（vs ITO导电玻璃）电位为-10 V时用6 SSC缓冲溶液反复冲洗后的SPR光谱；（5）再生处理后的SPR光谱,cDNA:5-GGTTGTGAGGCG CTGCCCAAGCGA-3,Analyst 2008,133（9):1274-1279,基于纳米金颗粒辅助的电洗脱识别单碱基错配DNA,（1）氨基修饰的DNA探针固定在金膜表面后的SPR光谱；（2）与33 nM smDNA1
24、杂交之后的SPR光谱；（3）再与纳米金颗粒标记的巯基DNA反应之后的SPR光谱；（4）在Au膜（vs ITO导电玻璃）电位为-8 V时用6 SSC缓冲溶液反复冲洗后的SPR光谱；（5）再生处理后的SPR光谱,smDNA1:5-GGTTGTGAGGCG GTGCCCAAGCGA-3,错配位点在与纳米金颗粒标记的巯基DNA相对应部分,smDNA6:5-GGTTGTGAGGCC CTGCCCAAGCGA-3,（1）氨基修饰的DNA探针固定在金膜表面后的SPR光谱；（2）与33 nM smDNA1杂交之后的SPR光谱；（3）再与纳米金颗粒标记的巯基DNA反应之后的SPR光谱；（4）在Au膜（vs IT
25、O导电玻璃）电位为-10 V时用6 SSC缓冲溶液反复冲洗后的SPR光谱；（5）再生处理后的SPR光谱,错配碱基在与金膜表面固定化DNA探针相对应的部分,（1）与33 nM smDNA1（A）或smDNA6（B）杂交；（2）与过量的纳米金颗粒标记的巯基DNA或者巯基DNA反应；（3）当Au膜（相对于ITO导电玻璃）的电位为-8V（A）或-10V（B）时用6 SSC缓冲溶液反复冲洗5 min；（4）再生,电洗脱对有或无纳米金颗粒参与的单碱基错配DNA杂交形成的dsDNA的影响,基于角度调制的SPR传感装置,SPR对附着在金属薄膜表面的介质折射率非常敏感,当表面介质的属性改变或者附着量改变时，共振
26、角将不同。因此，SPR谱（共振角的变化vs时间）能够反映与金属膜表面接触的体系的变化。,典型响应模式,Science 2002,295:2103-2105,Biacore 2000Dimensions:760 x 350 x 610 mmNet Weight:50 kg,Spreeta 2000,典型仪器,微流控SPR芯片,The Integrated microfluidics Cartridges used in the Biacore3000,SPR的应用,对生物分子进行识别及定量检测研究生物分子间的相互作用,用SPR可获得的信息：两个分子之间结合的特异性目标分子的浓度结合以及解离过程的
27、动力学参数结合的强度,SPR的优点,待测物无需标记适用于混浊、不透明或者有色溶液能实时、连续监测反应动态过程检测方便、快捷应用范围广,SPR缺点,难以区分非特异性吸附对温度、样品组成等干扰因素敏感,SPR技术发展动态,提高检测灵敏度高通量检测（SPR imaging）与质谱等高分辨仪器联用敏感器件及测量装置的微型化,微流控多通道SPR检测,Anal.Chem.2001,73:5525-5531,SPR扫描显微镜,Optics Communications 2000,182:1115,多波长SPR成像,a 630 nm，b 690 nm，c 750 nm.,Rev.Sci.Instrum.2000,71:3530-3538,SPR-MS,Anal.Chem.2000,72,4193-4198,SPR-MS,Anal.Chem.(2000)404 A-411 A,
