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1、第二章基因克隆的工具酶,周毅峰2013春,基因克隆的工具酶（instrumental enzyme of gene cloning）:,应用于基因克隆中的各种酶的总称。,通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，从而导致核酸分子多核苷酸链发生水解断裂的蛋白酶叫做核酸酶。,专门水解断裂RNA分子的叫做核糖核酸酶（RNase）,特异水解断裂DNA分子的则叫做脱氧核糖核酸酶（DNase）,从核酸分子的末端开始，一个核苷酸一个核苷酸地消化降解多核苷酸链，叫做核酸外切酶（exonuclease）,从核酸分子内部切割磷酸二酯键使之断裂形成小片段，叫做核酸内切酶（endonuclease）,1限制性核酸
2、内切酶(restriction enzyme),for the discovery of restriction enzymes and their application to problems of molecular genetics,The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1978,Werner Arber Switzerland 1929,Daniel Nathans USA 19281999,Hamilton O.Smith USA1931,一类能从DNA分子中间水解磷酸二酯键,从而切断双链DNA的核酸水解酶。它们不同于一般的脱氧核糖核酸
3、酶（DNase），它们的切点大多很严格，要求专一的核苷酸顺序识别顺序。,restriction enzyme,限制性核酸酶的发现,为基因结构、DNA碱基顺序分析和基因工程的研究开辟了途径。,1.1寄主控制与修饰现象(Restriction and modification),The opposing activities of restriction and modification are the two components of a bacterial defence mechanism.,Restriction,or DNA cleavage,is the means by which
4、 the host bacteria prevents infection by bacterial viruses(bacteriophage).The DNA of the incoming phage is recognised as foreign and cleaved by a restriction endonuclease.,在Ecoli.K上生长的噬体则表示为（K）。实验表明，用这种（K）噬菌体感染Ecoli.B，形成噬菌斑的效率就很低因此（K）噬菌体受到了B菌体的限制。,Modification,DNA methylation,is the mechanism by whi
5、ch the host bacteria protects its own DNA from cleavage by the restriction endonuclease.A modification methyltransferase methylates the DNA at the same recognition sequence that the restriction endonuclease uses to bind to the DNA prior to cleavage.This activity discriminates self DNA from foreign D
6、NA.,In vivo restriction of bacteriophage lambda by two different restriction systems.,The restriction level is shown as a reduction in the number of plaques produced by the phage.The two plates at the right show a significant reduction in the number of plaques due to restriction activity.,Restrictio
7、n,Modification,1.2限制性内切酶的种类,型的酶要求DNA分子上有特定的识别顺序，但是切点却不在此识别顺序之中，而与之有一定距离。在反应中，要求有ATP和S-腺苷甲硫氨酸（SAM）。酶由不同的、亚基组成。全酶兼有限制性内切酶的活性和甲基化酶的活性。,按其性质可分为三大类,型的酶与型的酶有相似特征，只是切点距识别顺序距离是严格的。,限制性核酸酶在原核和真核细胞中都有发现,不兼有甲基化酶的活性，细胞内另有独立的甲基化酶。它切断DNA时不需ATP，也不需SAM。它的切点是严格的，而且就在识别顺序之中。,型的酶，独立的限制性核酸内切酶,型的酶在蛋白质组成上比型、型要简单的多，它只有单一的
8、亚基，以二体或四体发挥作用。,1.3限制性核酸内切酶的命名,属名 种名 株名,Haemophilus influenzae d 嗜血流感杆菌d株,H i n d III Hind III,同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶,EcoREscherichia coli（大肠杆菌）RY13之酶HindHaemophilius influenzae（嗜血流感杆菌）Rd之酶Alu Arthrobacter luteus（藤黄节杆菌）之酶HaeHaemophilus aegyptius（埃及嗜血菌）之酶,在DNA分子双链的特异性识别序列部位，切割DNA分子产生链的断裂,2个单链断裂部位在DNA分子
9、上的分布，通常不是彼此直接相对的,断裂的结果形成的DNA片段，也往往具有互补的单链延伸末端,1.4II 型限制性核酸内切酶的基本特性,识别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列,大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧,识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构,EcoRI等产生的5粘性末端,EcoR,37,PstI等产生的3粘性末端,5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5,PstI 37,5 G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-P OH-A-C-G-T-C-C-T-C 5,PvuI
10、I等产生的平头末端,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 5,PvuII 37,5 G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C 5,1.5同裂酶和同尾酶,同裂酶(isochizomer):也叫同切点酶，异源同工酶，这类酶识别相同的序列，但是切割点不一定在同一点上。,同尾酶(isocaudamer)：是一类来源不同中，识别序列也不同，但对DNA切割所产生的粘性末端相同的一类酶。,Sau3A和BamH同尾酶所形成的杂种位点对Sau3A敏感，但不是Ba
11、mH的识别位点识别,杂种位点(hybrid site):,杂种位点一般不能被原来的任何一种同尾酶所识别。,由一对同尾酶所产生的粘性末端共价结合形成的位点。,不过也有例外：,BamH 来自Bacillus amyloliquefaciens H 解淀粉芽孢杆菌,Sau3A 来自Staphylococcus aureus 3A(J.S.Sussenbach)金黄色葡萄球菌,1.6限制片段末端的连接作用,由限制酶产生的具粘性末端的DNA片段间的连接作用有两种不同的类型,不同的DNA片段通过互补的粘性末端之间的碱基配对而彼此连接起来,分子间的连接：,AATTC-G3,G-CTTAA5,5AATTC-G
12、,3G-CTTAA,5AATTC-G,3 G-CTTAA,AATTC-G3,G-CTTAA5,T4 ligase,由同一片段的2个互补末端之间的碱基配对而形成的环形分子。,分子内的连接：,T4 ligase,1.7 大部分II 型核酸内切酶需要相似的反应条件,Tris-HCl,50 mM pH 7.5,MgCl2,10 mM,NaCl,0-150 mM,DTT,1 mM,Volume,20-100 l,Tep.and Time,37,1-1.5 hr,0-50 mM 低盐酶,100 mM 中盐酶,150 mM 高盐酶,1 U 核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应 1 小时，完全水解 1 g
13、 标准DNA所需的酶量,1.8 影响核酸内切限制酶活性的因素,DNA的纯度,蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等,加大酶的用量，1 mg DNA 用 10U 酶,加大反应总体积,延长反应时间,DNA样品的甲基化程度,大肠杆菌中的dam甲基化酶在5GATC3序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影响的酶有Bcl I、MboI等，但BamH I、Bgl II、Sau3A I不受影响,大肠杆菌中的dcm甲基化酶在5CCAGG3或5CCTGG3序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的酶有EcoR II等哺乳动物中的甲基化酶在5CG3序列中的C5位上引入甲基,酶切消化反应温度,不同酶之间
14、所需最适反应温度不同，且彼此间有相当大的变动范围。大多数酶标准反应温度都是37。,例外：,Sma 25Apa 30Mae 45Taq 65,DNA的分子结构,DNA分子的不同构型对核酸内切限制酶的活性也有很大的影响。某些核酸内切限制酶切割超盘旋的质粒DNA或病毒DNA所需要的酶量，要比消化线性DNA的高出许多倍，最高的可达20倍。此外，还有一些核酸内切限制酶，切割它们自己的处于不同部位的限制位点，其效率亦有明显的差别。,核酸内切限制酶的缓冲液,核酸内切酶的标准缓冲液的组份包括：氯化镁、氯化纳或氯化钾、Tris-HCl，-巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)以及牛血清白蛋白（BSA）等。酶活性的正常发
15、挥，是绝对地需要二价的阳离子，通常是Mg2+。不正确的NaCl或Mg2+浓度，不仅会降低限制酶的活性，而且还可能导致识别序列特异性的改变。,缓冲液Tris-HCl的作用在于使反应混合物的pH恒定在酶活性所要求的最佳数值的范围之内。对绝大多数限制酶来说，在pH=7.4的条件下，其功能最佳。,巯基试剂对于保持某些核酸内切限制酶的稳定性是有用的，而且还可保护其免于失活。但它同样也可能有利于潜在污染杂质的稳定性,有一部分核酸内切限制酶对于钠离子或钾离子浓度变化反应十分敏感而另一部分核酸内切限制酶则可适应较广的离子强度的变化幅度,BSA的作用酶保护剂，在反应中保证酶具有最佳的活性,高浓度的酶、高浓度的甘
16、油、低离子强度、极端pH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的星号活性（Star activity）现象,EcoR I在正常条件下识别并切割5GAATTC3序列，但在甘油浓度超过5%（v/v）时，也可切割5PuPuATPyPy3或者5AATT3,不同的酶生产厂家适合各种不同反应的缓冲液,TakaraNEBLTI(Gibcol-BRL)PromegaRocheMBI华 美,Takara,美国总部：Beverly,MA,缓冲液成份(1x)：NEBuffer 1(黄色)：10 mM Bis Tris 丙烷-HCl,10 mM MgCl2,1 mM DTT(pH 7.0 25C
17、)。NEBuffer 2(蓝色)：10 mM Tris-HCl,10 mM MgCl2,50 mM NaCl,1 mM DTT(pH 7.9 25C)。NEBuffer 3(红色)：50 mM Tris-HCl,10 mM MgCl2,100 mM NaCl,1 mM DTT(pH 7.9 25C)。NEBuffer 4(绿色)：20 mM Tris-Ac,10 mM Mg（Ac）2,50 mM KAc,1 mM DTT(pH 7.9 25C)。,NEB缓冲液,NEB稀释缓冲液成份：稀释液A：50 mM KCl,10 mM Tris-HCl,0.1 mM EDTA,1 mM DTT,200 g
18、/ml BSA和50%甘油(pH 7.4 25C)。稀释液B：300 mM NaCl,10 mM Tris-HCl,0.1 mM EDTA,1 mM DTT,500 g/ml BSA和50%甘(pH7.4 25C)。稀释液C：250 mM NaCl,10 mM Tris-HCl,0.1 mM EDTA,1 mM DTT,0.15%Triton X-100,200 g/ml BSA和50%甘油(pH 7.4 25C)。,ATP依赖的DNA连接酶,NAD依赖的DNA连接酶,大多数原核生物DNA连接酶,真核生物和病毒DNA连接酶，如T4DNA连接酶、真核生物DNA连接酶、,2DNA连接酶,DNA连接
19、酶（ligase）：在一条DNA链的3末端具有一个游离的羟基（-OH），和在另一条DNA链的5-末端具有一个磷酸基团（-P）的情况下，能够催化在2条DNA链之间形成的磷酸二酯键,用于共价连接DNA限制片段的连接酶有两种不同的来源,由Ecoli染色体编码的DNA连接酶,由Ecoli T4噬菌体DNA编码的T4DNA连接酶,用NAD+作能源辅助因子,ATP作能源辅助因子,DNA连接酶的反应条件,Tris-HCl,50-100 mM pH 7.5,MgCl2,10 mM,ATP,0.5-1mM,DTT,5 mM,Volume,10-20l,Tep.and Time,4-15,4-16 hr,1 U
20、DNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下15 反应 1 小时，完全连接 1 g DNA（Hind III片段）所需的酶量,平末端DNA片段的连接操作,从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多提高平末端连接效率的方法包括：,加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接）,加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会,加入10%PEG8000，促进大分子之间的有效作用,加入单价阳离子（NaCl），最终浓度150-200 mM,常用的平末端DNA片段连接法，主要有同聚物加尾法、衔接物连接法及接头连接法,同聚物加
21、尾法,衔接物连接法,衔接物（linker），是指用化学方法合成的一段由1012个核苷酸组成、具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸短片段。,DNA接头，是一类人工合成的一头具某种限制酶粘性末端另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片段。,3DNA聚合酶,分子生物学研究工作中经常使用的DNA聚合酶,功能：对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。,DNA-pol（109kD）,323个氨基酸,小片段,5 核酸外切酶活性,大片段/Klenow 片段,605个氨基酸,DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶活性,N 端,C 端,DNA-pol,Klenow片段的用途：,Klenow
22、片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。,a 补齐DNA 3隐缩未端b 标记DNA片段未端c cDNA合成第二链 d DNA测序,DNA分子的单链缺口上，DNA聚合酶的5 3核酸外切酶活性和聚合作用可以同时发生。当外切酶活性从缺口的5端移去一个5核苷酸之后，聚合作用就会在缺口的3端补上一个新的核苷酸。5端的核苷酸不断地被移去，3端的核苷酸又按序地增补，于是缺口便沿着DNA分子合成的方向移动。这种移动特称为缺口转移（nick translation）,T4-DNA聚合酶,T4-DNA酶的基本特性：,53的DNA聚合酶活性和35的核酸外切酶活性,在无dNTP时，可以从任何3-OH
23、端外切,在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止,在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位,T4-DNA聚合酶的基本用途：切平由核酸内切酶产生的3粘性末端,5 G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-P HO-A-C-G-T-C-C-T-C 5,T4-DNA聚合酶,5 G-C-T-C-OH P-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-P HO-C-C-T-C 5,注意：该酶也能降解双链DNA，只是其活性比单链降解活性低很多,T4-DNA聚合酶的基本用途：DNA片段的同位素末端标记,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 3,3
24、C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5,T4-DNA pol,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-OH,HO-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5,T4-DNA pol,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T-OH3,3HO-C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5,32P-dNTP,4依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶）,反转录酶的基本特性：以RNA为模板聚合cDNA链,3AAAAAAAAAAAAAA,5mRNA,5TTTTTTTTTTTT oligo(dT)12-18,反转录酶,Mg2+dNTP,3AAAAAAAAAAAAAA,5mRN
25、A,5TTTTTTTTTTTTTTTT,3cDNA,反转录酶的基本特性：双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链,3,5mRNA,5,3cDNA,3,5mRNA,5,3cDNA,反转录酶,5,3cDNA,反转录酶,5核酸酶,5.1核酸外切酶VII（ExoVII）,大肠杆菌的核酸外切酶VII不需要Mg2+,3,5,5,3,3,5,5,3,ExoVII,ExoVII,ExoVII,大肠杆菌核酸外切酶包括两个亚基组成单位，它们分别为xseA和xseB基因的编码产物。它能够从5-末端或3-末端降解DNA分子，产生出寡核苷酸短片段。,5.2核酸外切酶 III（ExoIII）,3,5,5,3,Exo,Mg
26、2+dNTP,5,3,3,5,核酸外切酶，系由大肠杆菌xthA基因编码的单体蛋白质。,核酸外切酶的主要活性是，按3 5的方向催化双链DNA自3-OH末端释放5-单核苷酸,通过其3 5活性使双链DNA分子产生出单链区,5.3 核酸外切酶（exo）,核酸外切酶最初是从感染了噬菌体的大肠杆菌细胞中纯化出来的。这种酶催化双链DNA分子自5-P末端进行逐步的加工和水解，释放出5单核苷酸，但它不能降解5-OH末端,将双链DNA转变成单链的DNA，供双脱氧法进行DNA序列分析使用,从双链DNA中移去5突出末端，以便用末端转移酶进行加尾,核酸外切酶的用途,5单链核酸内切酶,5.1S1核酸酶,S1核酸酶，是一种
27、高度单链特异的核酸内切酶，在最适的酶催反应条件下，降解单链DNA的速率要比双链DNA的快75 000倍,需要低水平的Zn2+离子，最适pH值4.04.3,催化RNA和单链DNA分子降解成为5单核苷酸。,S1核酸酶的主要功能,同时它也能作用于双链核酸分子的单链区，并从此处切断核酸分子。,Bal31核酸酶,既具有单链特异的核酸内切酶活性，同时也具有双链特异的核酸外切酶活性,当底物是双链环形的DNA，Bal31的单链特异的核酸内切酶活性，通过对单链缺口或瞬时单链区（transient single stranded regions）的降解作用，将超盘旋的DNA切割成开环结构，进而成为线性双链DNA分
28、子。,当底物是线性双链DNA分子时，Bal31的双链特异的核酸外切酶活性，又会成功地从3和5两末端移去核苷酸，并且能够有效地控制此种DNA片段逐渐缩短的速度,诱发DNA发生缺失突变,主要用途包括：,研究超盘旋DNA分子的二级结构，并改变因诱变剂处理所出现的双链DNA的螺旋结构,定位测定DNA片段中限制位点的分布,缺失突变,6核酸修饰酶,6.1末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT）,在二甲胂酸缓冲液中，能够催化5脱氧核苷三磷酸进行5 3方向的聚合作用，逐个地将脱氧核苷酸分子加到线性DNA分子的3-OH末端,6.2碱性磷酸酶,从大
29、肠杆菌中纯化出来的，叫做细菌碱性磷酸酶（bacterial alkaline phosphatase，简称BAP）从小牛肠中纯化出来的，叫做小牛肠碱性磷酸酶（calf intestinal alkaline phosphatase，简称CIP）。,有两种不同来源的碱性磷酸酶：,能够催化核酸分子脱掉5磷酸基团，从而使DNA（或RNA）片段的5-P末端转换成5-OH末端，这就是所谓的核酸分子的脱磷酸作用,碱性磷酸酶的这种功能，对于DNA分子克隆是很有用的。,可作为5-末端标记的DNA片段。,在DNA体外重组中，为了防止线性化的载体分子发生自我连接作用，也需要从这些片段上除去5-P基团。,6.3 T4多核苷酸激酶(T4-PNP),T4-PNP的基本特性：在DNA、RNA、dNR、NR的5-OH上加磷,由T4噬菌体的pseT基因编码的一种蛋白质，最初也是从T4噬菌体感染的大肠杆菌细胞中分离出来的,本章结束!谢谢!,
