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1、第三章 工业发酵培养基,发酵生产的一般流程,菌种,培养基,过滤,下游提取,扩大培养,产品,空气,灭菌,培养基组成对菌体生长繁殖、产物的生物合成、产品的质量和产量、产品的分离精制都有重要的影响。,1、按培养基成分,1）合成培养基,所用原料的化学成分明确、稳定 如葡萄糖、硫酸铵 用于实验室范围作有关营养、代谢、分类鉴定、选育菌种、遗传分析定量研究工作；在生产某些疫苗的过程中，为了防止其他蛋白质等杂质掺入，也常用合成培养基；营养单一、价格较高，不适于大规模生产,2）天然培养基,原料是一些天然动、植物产品 如花生饼粉、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、麦芽汁、玉米浆等 来源广泛（大多为农副产品）、营养丰富、价格
2、低廉、适于工业化生产 一般不需要另加微量元素、维生素等物质 由于成分复杂，不易重复，如对原料质量等方面不加控制会影响生产稳定性,3）半合成培养基,既含天然成分，又含纯化学试剂发酵工业中使用的培养基绝大多数是半合成培养基,培养基的分类,2、按物理状态分,1）固体,适于菌种和孢子的培养与保存，传统发酵食品的生产，也广泛应用于有子实体的真菌类，如香菇、木耳等的生产；近年来由于机械化程度的提高，在发酵工业上又开始应用固体培养基进行大规模生产，其组分常用麸皮、大米、小米、木屑、禾壳等。,2）半固体,琼脂0.5%-0.8%主用于鉴定细菌、观察细菌运动特征及噬菌体的效价测定等,3）液体,发酵工业大规模使用的
3、培养基,发酵培养基的成分、作用及来源,培养基通常都含有微生物生长繁殖所必须得碳源（能源）、氮源、无机盐及微量元素、生长因子和水等营养成分。有些还含有前体、产物促进剂、诱导剂和抑制剂等。,水、氧、螯合剂、缓冲剂、消泡剂等,一、碳源,凡是作为微生物细胞结构或者代谢产物中碳架来源的营养物质，都称为碳源。主要功能：1）为菌体的生长繁殖提供能源和合成菌体所必需的成分；2）为合成目的产物提供所需的碳元素成分。,一、碳源,常用的碳源:,糖类 油脂 有机酸 低碳醇等,1、糖类,发酵培养基中使用最广泛的碳源;主要有葡萄糖、糖蜜和淀粉糊精等,工业上常用的糖类及来源,淀粉水解糖的制备是发酵生产的一项重要工艺，将在后
4、面详细介绍,最易利用，几乎所有微生物都能利用 葡萄糖常作为培养基的一种主要成分。但过多的葡萄糖会过分加速菌体的呼吸，以至培养基中的溶解氧不能满足需要，抑制微生物的生长和产物的合成。,葡萄糖,糖蜜 制糖的结晶母液，它是制糖工业的副产物;含有丰富的糖、氮类化合物、无机盐和维生素等，是微生物发酵培养基价廉物美的碳源;糖蜜主要含有蔗糖，总糖可达45-50%。水分含量：18-36%。粗蛋白质含量2.5-8%，粗灰分4%-12.5%。糖蜜分甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜，二者在糖的含量和无机盐的含量上有所不同，即使同一种糖蜜由于加工方法不同其成分也存在差异，因此使用时要注意。,淀粉 多糖，也是常用的碳源;需经胞外酶水
5、解成单糖后再被吸收利用;使用淀粉可克服葡萄糖代谢过快的弊病，价格也比较低廉，在发酵工业中被普遍使用。常用的淀粉为玉米、甘薯、马铃薯、木薯淀粉。,脂肪也能被许多微生物作为碳源和能源 这些微生物都具有比较活跃的脂肪酶，在脂肪酶的作用下，油或脂肪被水解为甘油和脂肪酸，在溶解氧的参与下，进一步氧化成CO2和H2O，并释放出大量的能量。当微生物利用脂肪作为碳源时，要供给比糖代谢更多的氧，不然大量的脂肪酸和代谢中的有机酸会积累，从而引起pH的下降，并影响微生物细胞中酶的活力。常用豆油、菜油、葵花籽油、猪油、鱼油、棉籽油等,2、脂肪,随着石油工业的发展，发酵工业的碳源也有所扩大。如正烷烃（一般指从石油裂解中
6、得到的14-18碳的直链烷烃混合物）已用于有机酸、氨基酸、维生素、抗生素和酶制剂的工业发酵中。,3、烃和醇类,4、有机酸,一些微生物对许多有机酸（如乳酸、柠檬酸、乙酸等）有很强的氧化能力。因此有机酸或它们的盐也能作为微生物的碳源。,有机酸的利用常会使pH值上升。,影响碳源选择的因素有哪些？,1、碳源的代谢速率,2、价格,3、纯度：,4、培养基的配制方法，尤其是灭菌方法。,5、政府的政策和法规。,二、氮源,有机氮源 豆饼（粕）粉、花生饼粉、棉籽饼粉、鱼粉、蚕蛹粉、酵母粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、废菌丝体、酒糟、尿素等,无机氮源 氨水、铵盐、硝酸盐等,氮源物质常对培养液pH产生影响(NH4)S
7、O4 2NH3+H2SO4 NaNO3+4H2 NH3+2H2O+NaOH 在常用的无机氮中，硫酸铵被菌体利用后会使培养液的pH下降，为生理酸性物质；硝酸钠被同化时则引起培养液pH上升，为生理碱性物质,如何合理使用生理酸碱性物质？,氨水,1、氨水使用的普遍性及其作用。红霉素；链霉素,2、局部过碱及解决方案。,3、嗜碱性微生物的污染及防治。,无机氮源和尿素、玉米浆等可被迅速利用，为速效氮。蛋白质氮则需先水解成肽和氨基酸后才能被吸收利用，属迟效氮。,三、生长因子,概念：微生物生长不可缺少的微量有机物质。,类别：维生素、氨基酸、嘌呤嘧啶及其衍生物,不是所有微生物都必需的，只是对于某些自己不能合成这些
8、成分的微生物才是必不可少的营养物质。,如以糖质原料为碳源的谷氨酸生产菌为生物素缺陷型，以生物素为生长因子。,提供生长因子的农副产品原料,1）玉米浆（corn steep liquor,CSL）,用亚硫酸浸泡玉米而得的浸泡液的浓缩液，也是玉米淀粉生产的副产品,虽然主要用作氮源，但它含有丰富的氨基酸、核酸、维生素、无机盐等，常用作为提供生长因子的物质。,2）麸皮水解液,可代替玉米浆，蛋白质、氨基酸等营养成分比玉米浆少。,用量一般为1%（以干麸皮计）左右,水解条件：以干麸皮：水：HCl=4.6:26:1配比混合，装入水解锅中以0.070.08MPa表压加热水解7080min。以干麸皮：水=1：20，
9、用盐酸调pH值1.0，以0.25MPa表压加热水解20min。然后过滤取滤液。,3）糖蜜（molasses）,甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜均可代替玉米浆，但氨基酸等有机氮含量较低,4)酵母,酵母膏、酵母浸出液、酵母粉,5）其他,牛肉膏、蛋白胨、动物心、肝等组织浸液等都含有丰富的生长因子,四、水,1）是微生物机体的重要组成部分2）进行代谢反应的介质3）营养物、代谢物、氧气等必须溶解于水后才能通过细胞表面进行正常的活动；4）水的比热高，能有效吸收代谢过程中放出的热，使细胞内温度不致骤然上升；同时水又是热的良导体，有利于散热，可调节细胞温度。,对于发酵工厂来说，恒定的水源是至关重要的，因为在不同水源中存在的各
10、种因素对微生物发酵代谢影响甚大，特别是水中的矿物质组成对酿酒工业影响甚大。水源质量的主要参数包括pH值、溶解氧、可溶性固体、污染程度以及矿物质组成和含量。对于常规发酵，可靠、持久，能提供大量成分一致清洁的水，生产中使用的水有深井水、自来水、地表水等。,五、无机盐和微量元素,主要无机元素：磷、硫、钾、钠、钙、镁、铁等。微量无机元素：钼、锌、钴、铜、硼、溴等。微量无机元素需求量很少，但往往会强烈刺激微生物的生长发育。,磷酸盐,磷是某些蛋白质和核酸的组成成分磷酸盐在培养基中还具有缓冲作用微生物对磷的需要量一般为0.0050.01mol/L常用K3PO4、Na2HPO4、NaH2PO4,硫酸镁,Mg
11、2+是许多重要酶（如己糖磷酸化酶、异柠檬酸脱氢酶、羧化酶等）的激活剂镁离子能提高一些氨基糖苷类抗生素产生菌对自身所产的抗生素的耐受能力，如卡那霉素、链霉素、新生霉素等产生菌。硫存在于细胞的蛋白质中，是含硫氨基酸的组成成分硫是构成一些酶的活性基团硫酸镁加入培养基中，在碱性条件下会形成氢氧化镁沉淀，配料时要注意。,钾盐,钾不参与细胞结构物质的组成是许多酶的激活剂菌体生长所需钾量约为0.1g/L(以K2SO4计),微量元素,需量微少，但又不可缺少一般作为碳、氮源的农副产物天然原料中，本身含有，不必另加某些金属离子，特别是汞离子和铜离子，具有明显的毒性,六、前体(precursor),概念：指某些化合
12、物加入到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而又较大的提高。,发现：最早是从青霉素的生产中被发现的。加入玉米浆后，青霉素单位可从20U/ml增加到100U/ml；玉米浆中含有苯乙胺，它能被优先合成到青霉素分子中，从而提高青霉素G的产量。,青霉素G,苯乙胺,大多数前体，例如苯乙胺对微生物的生长有毒性，以及菌体具有将前体氧化分解的能力，因此在生产中为了减少毒性和增加前体的利用率，常采用少量多次的流加工艺。苯乙酸，一般基础料中仅仅添加0.07%。,七、促进剂和抑制剂,1、促进剂：促进剂是指那些非细胞生长所必需的营养物
13、，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。,各种促进剂对产酶的促进作用,促进剂不是前体或营养物 可影响正常代谢，或促进中间代谢产物的积累，或提高次级代谢产物的产量,例如 巴比妥可增加链霉素产生菌的抗自溶能力，推迟自溶时间，增加链霉素积累。,促进剂提高产量的机制:,各种促进剂的效果除受菌种、菌龄的影响外，还与所用的培养基组成有关，即使是同一种促进剂，用同一菌株，生产同一产物，在使用不同的培养基时效果也会不一样。,如在酶制剂生产中，有些促进剂本身是酶的诱导物；有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改善细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产，也有人认为表面活性剂对酶的表面失活有保护作用；有些促进剂
14、的作用是沉淀或鳌合有害的金属离子。,2、抑制剂 抑制某些代谢途径的进行，同时刺激另一代谢途径，以致可以改变微生物的代谢途径。,如酵母厌氧发酵中加入亚硫酸盐或碱类，可以使酒精发酵受到抑制，而转入甘油发酵,某些代谢产物的抑制剂,发酵培养基的设计与优化,设计发酵培养基的四个要求：,1目的明确2营养协调3条件适宜4经济节约,1目的明确,首先要明确配制该培养基的目的 实验室研究，不必过多计较成本大规模的发酵生产种子培养基与发酵培养基主流代谢产物一般指通过主要代谢途径产生的那些结构较简单、产量较高、价值较低的降解产物 次级代谢产物 一般是指通过复杂合成途径产生的那些结构复杂、产量低、价值高的合成产物,一般
15、只有小分子能够通过细胞膜进入细胞内进行代谢；微生物能够利用复杂的大分子是由于分泌各种水解酶，在体外将大分子水解为微生物能直接利用的小分子;微生物来源和种类不同，所分泌的水解酶系不同；有的微生物由于水解酶系的缺乏，只能利用简单物质；,在考虑某一菌种对培养基的总体要求时，在成分选择时应注意菌体的同化能力,在碳源和氮源的选取时特别要注意，许多碳源和氮源都是复杂的有机大分子，如淀粉、黄豆饼粉等；用这类原料，微生物须具备分泌胞外淀粉酶和蛋白酶。,培养不能分泌淀粉酶的菌株，可先将淀粉糖化,有些微生物，如大多数氨基酸产生菌，缺乏蛋白水解酶，可先将有机氮源水解 豆饼水解液制备方法：豆饼粉（100kg）+水(1
16、33kg)+盐酸，调pH1.0以下，100C，常压水解16h，或0.25-0.3MPa压力水解6h，也可用硫酸水解，用氨中和。,2营养协调,在大多数异养菌的培养基中，各营养要素在量上的比例大体符合以下十倍序列的递减规律：要素：H2OC+能源N源P、SK、Mg生长因子含量：(10-1)(10-2)(10-3)(10-4)(10-5)(10-6),6,不同生长阶段，对碳氮比的最适要求可能不同。一般来讲，因为碳源既作为碳架参与菌体和产物的合成，又作为生命过程中的能源，故比例要求比氮源高。一般工业发酵培养基的碳氮比为100:(0.2-2.0）;但在谷氨酸发酵中因产物含氮量较高，所以氮源比例相对高些，一
17、般取100:(15-20）。如碳氮比为100:(0.5-2.0），则只长菌体而不合成谷氨酸。,培养基成分选择的原则(continued),合适的碳氮比,碳氮比对生长繁殖以及产物合成的影响极其显著 氮源过多，会使菌体生长过旺，pH偏高，不利代谢产物的积累；氮源不足，则菌体繁殖量少，从而影响产量；碳源过多则易形成较低的pH；碳源不足则容易引起菌体的衰老和自溶。,碳氮比也随碳源及氮源的种类以及通气搅拌等条件而异。,碳氮比（CN比）,五种常用氮源的含氮量 NH3(82)CO(NH2)2(46)NH4NO3(35)(NH4)2CO3(29.2)(NH4)2SO4(21)普通培养基的CN比为1000.52
18、谷氨酸发酵培养基为1001121放线菌产蛋白酶培养基为1001020碳氮比(C/N)一般指培养基中元素C与N的比值。为方便测定和计算，人们常以培养基中还原糖含量与粗蛋白含量的比值来表示。,对于生产氨基酸等含氮的化合物时，它的发酵培养基除供给充足的碳源物质外，还应该添加足够的铵盐或尿素等氮素化合物。发酵培养基的各种营养物质的浓度应尽可能高些，这样在同等或相近的转化率条件下有利于提高单位容积发酵罐的利用率，增加经济效益。发酵培养基需耗用大量原料，因此，原料来源、原材料的质量以及价格等必须予以重视。,在设计营养物配比时，还应该考虑避免培养基中各成分之间的相互作用。如蛋白胨、酵母膏中含有磷酸盐时，会与
19、培养基中钙或镁离子在加热时发生沉淀反应。在高温下，还原糖与蛋白质或氨基酸也会相互作用产生褐色物质。在培养基配制时，可添加化学试剂补充宏量元素。其中，首选的是K2HPO4和MgSO4，因为它们包含了四种元素。对于微量元素，一般化学试剂、水及器皿上均有存在。,3条件适宜,pH是微生物生长和代谢的极为重要的环境因子；最适pH细菌pH 7.08.0放线菌pH 7.58.5酵母菌pH 3.86.0霉菌pH 4.05.8 微生物在利用营养物质后，由于酸碱物质的积累或代谢酸碱物质的形成，会造成培养体系中pH的波动；,（1）pH的要求,要保证发酵过程中pH能满足工艺的要求，合理配制培养基是决定因素，因而在配制
20、培养基选取营养成分时，除了考虑营养需求外，也要考虑其代谢后对培养体系pH缓冲能力的影响。不少微生物有很强的产酸能力，如不适当地加以调节，就会抑制甚至杀死其自身。,pH调节内源调节：1）磷酸盐缓冲液；调节K2HPO4和KH2PO4两者浓度比，可获得从pH6.0到pH7.6间一系列稳定的pH，当两者等摩尔浓度比时，溶液的pH可稳定在6.8。其反应式如下：K2HPO4+HCl KH2PO4+KClKH2PO4+KOH K2HPO4+H2O2）CaCO3外源调节：酸碱调节。（第六章）,（2）渗透压,等渗溶液适宜生长高渗溶液质壁分离低渗溶液吸水膨胀,（3）水活度,水活度（w）：它表示在天然环境中，微生物
21、可实际利用的自由水或游离水的含量。wPwP0w式中Pw代表溶液蒸气压力，P0w代表纯水蒸气压力。纯水w为1.00，溶液中溶质越多，w越小。,（4）氧化还原势,氧化还原势：又称氧化还原电位，其单位是V（伏）或mV（毫伏）。一般用Eh表示。,各种微生物对的氧化还原势的要求,好氧微生物：Eh值+0.3+0.4V兼性厌氧微生物：+0.1V好氧呼吸+0.1V进行发酵厌氧微生物：+0.1V还原剂：巯基乙酸（0.010.20）、抗坏血酸（0.1）硫化钠（0.025）、铁屑、庖肉氧化还原指示剂：刃天青（一种氧化还原指示剂，在缺氧环境下由粉红变为无色）,4经济节约,(1)以粗代精。例：红糖与白糖(2)以野代家。例：木薯、橡子、薯芋、(3)以废代好例：亚硫酸废液、糖蜜、玉米浆(4)以简代繁,(5)以烃代粮例：高级醇、脂肪酸和环烷酸(6)以纤代糖例：稻草、麦秆、稻壳、棉子壳和玉米芯(7)以氮代朊例：氮气、铵盐、硝酸盐或尿素(8)以国代进例：五十年代国内青霉素发酵,
