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1、基因治疗的原理,一、基因治疗的策略,内容提要,二、基因转移技术,三、基因干预,一、基因治疗的策略,（一）基因置换（gene replacement）,定义：指将特定的目的基因导入特定细胞，通过定位重组，以导入的正常基因置换基因组内原有的缺陷基因。,目的：将缺陷基因的异常序列进行桥正。,（二）基因添加,基因添加或称基因增补（gene augmentation）:通过导入外源基因使靶细胞表达其本身不表达的基因。,类型:在有缺陷基因的细胞中导入相应的正常基因，而细胞内的缺陷基因并未除去，通过导入正常基因的表达产物，补偿缺陷基因的功能。向靶细胞中导入靶细胞本来不表达的基因，利用其表达产物达到治疗疾病的
2、目的。,（三）基因干预基因干预（gene interference）:采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因的结构而使之不能表达，以达到治疗疾病的目的。,（四）自杀基因治疗自杀基因治疗:恶性肿瘤基因治疗的主要方法之一。原理:将“自杀”基因导入宿主细胞中，这种基因编码的酶能使无毒性的药物前体转化为细胞毒性代谢物，诱导靶细胞产生“自杀”效应，从而达到清除肿瘤细胞的目的。,（五）基因免疫治疗,通过将抗癌免疫增强细胞因子或MHC基因导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中的抗癌免疫反应。,二、基因转移技术,基因转移(gene transfer)技术,1.病毒介导的基因转移系统。2.非病毒介导的
3、基因转移系统。,1.病毒介导的基因转移系统,病毒载体介导的基因转移效率较高，因此它也是使用最多的基因治疗载体。据统计，有72%的临床实验计划和71%的病例使用了病毒载体，其中用得最多的是逆转录病毒载体。,(1)逆转录病毒载体,逆转录病毒载体的特点,逆转录病毒包膜上由env编码的糖蛋白，能够被许多哺乳动物细胞膜上的特异性受体识别，从而使逆转录病毒携带的遗传物质高效地进入靶细胞。,逆转录病毒结构基因gag、env和pol的缺失不影响其他部分的活性。,前病毒可以高效整合至靶细胞基因组中，有利于外源基因在靶细胞中的永久表达。,包装好的假病毒颗粒（携带目的基因的重组逆转录病毒载体）以芽生的方式分泌至辅助
4、细胞培养的上清液中，易于分离制备。,逆转录病毒载体的主要缺点,随机整合，有插入突变、激活癌基因的潜在危险；逆转录病毒载体的容量较小，只能容纳7 kb以下的外源基因。,（2）腺病毒(adenovirus，AV)载体 腺病毒是一种大分子(36 kb)双链无包膜DNA病毒。它通过受体介导的内吞作用进入细胞内，然后腺病毒基因组转移至细胞核内，保持在染色体外，不整合进入宿主细胞基因组中。腺病毒是人类呼吸道感染的病原体，但目前尚未发现与肿瘤发生有关联。宿主细胞范围广，可感染分裂和非分裂终末分化细胞，如神经元等。,腺病毒载体的优点,1.基因导入效率高，对人类安全；,2.宿主范围广；,3.基因转导与细胞分裂无
5、关；,4.重组腺病毒可通过口服经肠道吸收、或喷雾吸入或气管内滴注；,5.腺病毒载体容量较大，可插入7.5 kb外源基因；,腺病毒载体的缺点,2.宿主的免疫反应导致腺病毒载体表达短暂。,3.有两个环节可能产生复制型腺病毒。,4.靶向性差。,1.不能整合到靶细胞的基因组DNA中。分裂增殖快的细胞，导入的重组病毒载体，随分裂而丢失的机会增多，表达时间相对较短。,2.非病毒载体介导的基因转移系统（1）脂质体介导的基因转移技术 脂质体介导的基因转移技术使用方便、成本低廉。基本原理:利用阳离子脂质体单体与DNA混合后，可以自动形成包埋外源DNA的脂质体，然后与细胞一起孵育，即可通过细胞内吞作用将外源DNA
6、（即目的基因）转移至细胞内，并进行表达。,（2）受体介导转移技术,将DNA与细胞或组织亲和性的配体偶联，可使DNA具有靶向性。这种偶联通常通过多聚阳离子（如多聚赖氨酸）来实现。多聚阳离子与配体共价连接后，又通过电荷相互作用与带负电荷的DNA结合，将DNA包围，只留下配体暴露于表面。这样形成的复合物可被带有特异性受体的靶细胞吞饮，从而将外源DNA导入靶细胞。,（3）基因直接注射技术 不需要进行基因工程的繁琐操作，直接将裸露基因DNA注入动物肌肉或某些器官组织内。,三、基因干预,基因干预的种类：,1.反义RNA(antisense RNA)2.干扰RNA(RNA interference),（一）
7、反义RNA 1.反义RNA与基因表达调控 利用反义RNA对体外培养的细胞进行基因表达调控，通常采用的方法有两种：（1）体外合成反义RNA，直接作用于培养细胞，细胞吸收RNA后，发挥作用。（2）构建能转录反义RNA的重组质粒，将质粒转入细胞，转录出反义RNA而发挥作用。,2.受体介导反义RNA技转移术,基本原理：将脱唾液酸血清类粘蛋白（ASGP）与多聚赖氨酸（PL）共价连接，得到ASGP-PL复合物，成为运载核酸的工具。ASGP-PL反义RNA复合物可以专一性地被肝细胞表面的ASGP受体所识别，并吞噬到肝细胞中，反义RNA进入肝细胞后，可被逐渐释放出来发挥作用。,借助受体介导DNA转移方法把DN
8、A换成反义RNA，就可以实现受体介导的反义RNA的转移。,（二）干扰RNA,1.RNA干扰现象,RNA干扰（RNA interference，RNAi）是一种由双链RNA诱发的基因沉默现象。在此过程中，与双链RNA有同源序列的信使RNA（mRNA）被降解，从而抑制该基因的表达。,2.RNA干扰的机制,RNA干扰过程主要有2个步骤：,（1）小干扰性RNA（siRNA）,（2）siRNA与细胞内的某些酶和蛋白质形成复合体，称为RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex,RISC)。,该复合体可识别与siRNA有同源序列的mRNA，并在特异的位点将该mRNA切断。,长双链RNA被细胞内的双链RNA特异性核酸酶Dicer切成21-23个碱基对的短双链RNA，称为小干扰性RNA（small interfering RNA，siRNA）。,3.RNA干扰的应用前景 RNA干扰研究目前已经在功能基因组学研究、微生物学研究、基因治疗和信号转导等广泛领域取得了令人瞩目的进展，使其在医学、生物学领域的应用有着广阔的前景。,谢谢观看,
