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1、第七章,分子发光光谱法,分子荧光:Fluorescence分子磷光:Phosphorescence,molecular luminescence analysis,7.1 分子发光的基本原理,第一次记录荧光现象的是16世纪西班牙的内科医生和植物学家N.Monardes，1575年他提到在含有一种称为“Lignum Nephriticum”的木头切片的水溶液中，呈现了极为可爱的天蓝色。直到1852年，Stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光光度计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍微长些，才判断这种现象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光，而不是由光的漫射作用所引起的，从而导入了荧光是
2、光发射的概念，他还由发荧光的矿石“萤石”推演而提出“荧光”这一术语。1867年，Goppelsroder进行了历史上首次的荧光分析工作，应用铝桑色素配合物的荧光进行铝的测定。19世纪以前，荧光的观察是靠肉眼进行的，直到1928年，才由Jette和West提出了第一台荧光计。,一、荧光与磷光的产生过程luminescence process of molecular fluorescence phosphorescence,由分子结构理论，主要讨论荧光及磷光的产生机理。1.分子能级与跃迁 分子能级比原子能级复杂；在每个电子能级上，都存在振动、转动能级；基态(S0)激发态(S1、S2、激发态振动能
3、级)：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位；激发态基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势；第一、第二、电子激发单重态 S1、S2；第一、第二、电子激发三重态 T1、T2；,2.电子激发态的多重度,电子激发态的多重度：M=2S+1 S为电子自旋量子数的代数和(0或1)；平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则)，三重态能级比相应单重态能级低；大多数有机分子的基态处于单重态；,S0T1 禁阻跃迁；通过其他途径进入(见能级图)；进入的几率小；,2.激发态基态的能量传递途径(分子的去激过程),电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去
4、能量；,激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大，发光强度相对大；荧光：10-710-9 s,第一激发单重态的最低振动能级基态；磷光：10-410s；第一激发三重态的最低振动能级基态；,分子吸收和发射过程的Jablonski能级图,非辐射能量传递过程,振动弛豫：在凝聚相体系中，被激发到激发态(如S1和S2)的分子能通过与溶剂分子的碰撞迅速以热的形式把多余的振动能量传递给周围的分子，而自身返回该电子能级的最低振动能级，这个过程称为振动弛豫。发生振动弛豫的时间10-12 s。内转换：当S2的较低振动能级与S1的较高振动能级的能量相当或重叠时，分子有可能从S2的振动能级以无辐射方式过渡到S1
5、的能量相等的振动能级上。这个过程称为内转换。内转换发生的时间约为10-12 s。内转换过程同样也发生在激发态三重态的电子能级间。,由于振动弛豫和内转换过程极为迅速(10-12 s)，因此，激发后的分子很快回到电子第一激发单重态S1的最低振动能级。所以高于第一激发态的荧光发射十分少见。,外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁；外转换过程是荧光或磷光的竞争过程，因此，该过程使荧光或磷光减弱或“猝灭”。系间跨越：是不同多重态之间的一种无辐射跃迁。该过程是激发电子改变其自旋态，分子的多重性发生变化的结果。当两种能态的振动能级重叠时，这种跃迁的概率增大。如S1到T1跃迁就
6、是系间跃迁的例子，即单重态到三重态的跃迁。即较低单重态振动能级与较高的三重态振动能级重叠。这种跃迁是“禁阻”的。改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋轨道耦合进行。,辐射能量传递过程,荧光发射：当分子处于第一激发单重态S1的最低能级时，分子返回基态的过程比振动弛豫和内转化过程慢得多。分子可能通过发射光子跃迁回到基态S0的各振动能级上，这个过程称为荧光发射。电子由第一激发单重态的最低振动能级基态（多为 S1 S0跃迁），发射波长为 2的荧光；10-710-9 s。由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长；2 2 1；,磷光发射：激发态分子经过系间跨跃达到激发三重态后，并经过迅速的振动弛豫达到
7、第一激发三重态(T1)的最低振动能级上，从T1态分子经发射光子返回基态。此过程称为磷光发射。,磷光发射是不同多重态之间的跃迁(即T1 S0)，故属于“禁阻”跃迁。因此磷光的寿命比荧光要长很多，约为10-3到10s。所以，将激发光从磷光样品移走后，还常可以观察到发光现象，而荧光发射却观察不到该现象。,一.分子荧光与磷光的产生,1.单重态与三重态,2.分子的活化与去活化,3.分子发光的类型,按激发的模式分类：,按分子激发态的类型分类：,光致发光化学发光/生物发光热致发光场致发光摩擦发光,按光子能量分类：,斯托克斯荧光(Stokes)：ex em共振荧光(Resonance)：ex=em,分子的活化
8、与去活化,外转移,内转移,荧光,系间窜跃,磷光,反系间窜跃,迟滞荧光,振动弛豫,.无辐射跃迁的类型,振动弛豫:Vr 10-12sec外 转 移:无辐射跃迁回到基态内 转 移:S2S1能级之间有重叠系间窜跃:S2T1能级之间有重叠反系间窜跃:由外部获取能量后 T1 S2,.辐射跃迁的类型,共振荧光：10-12 sec荧 光：10-8 sec磷 光：110-4 sec迟滞荧光:10210-4 sec,二.分子荧光(磷光)光谱,1.荧光(磷光)激发光谱与发射光谱,荧光(磷光)均为光致发光，在光辐射的作用下，荧光物质发射出不同波长的荧光。,任何荧光分子都具有两种特征的光谱，即激发光谱和发射光谱。,荧光
9、(磷光)：光致发光，照射光波长如何选择？,A.荧光激发光谱,固定em=620nm(MAX),ex=290nm(MAX),固定发射波长扫描激发波长,荧光激发光谱与紫外-可见吸收光谱类似,固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光(磷光)强度与照射光波长的关系曲线。,B.发射光谱(荧光光谱),固定激发光波长(选最大激发波长),化合物发射的荧光(或磷光强度)与发射光波长关系曲线。,D.磷光光谱,与发射光谱相同条件下的磷光光谱,激发光谱,发射光谱,200,250,300,350,400,450,500,荧光激发光谱,荧光发射光谱,nm,蒽的激发光谱和荧光光谱,三、荧光光谱的特征激发光谱与发射光谱
10、的关系,1、Stokes位移,在溶液中，分子的荧光发射波长总是比其相应的吸收(或激发)光谱的波长长，荧光发射这种波长位移的现象称为Stokes位移。,处于激发态的分子一方面由于振动弛豫等损失了部分能量，另一方面溶剂分子的弛豫作用使其能量进一步损失，因而产生了发射光谱波长的位移，这种位移表明在荧光激发和发射之间所产生的能量损失。,2.镜像对称规则,通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。,镜像规则的解释,大多数吸收光谱的形状表明了分子的第一激发态的振动能级结构，而荧光发射光谱则表明了分子基态的振动能级结构,一般情况下，分子的基态和第一激发单重态的振动能级结构相似，因此
11、吸收光谱的形状与荧光发生光谱的形状呈镜像对称关系。,3、荧光发射光谱的形状与激发波长无关,一般地，用不同波长的激发光激发荧光分子，可以观察到形状相同的荧光发射光谱。,荧光分子无论被激发到哪一个激发态，处于激发态的分子经振动弛豫及内转换等过程最终回到第一激发态的最低振动能级。而分子的荧光发射总是从第一激发态的最低振动能级跃迁到基态的各振动能级上，所以荧光光谱的形状与激发波长无关。,分子吸收和发射过程的Jablonski能级图,2.三维荧光光谱,I F f(ex、em),蒽的激发光谱,固定发射波长、扫描激发波长,I F f(ex、em),蒽的发射光谱,固定激发波长、扫描发射波长,蒽的三维等高线光谱
12、图,蒽的三维等荧光强度光谱,VB1和VB2的三维荧光光谱,RLS,DS,TS,ATS,ADS,散射片三维共振光散射光谱,3.三维共振光散射光谱,ADS,ATS,TS,RLS,DS,散射片三维共振光散射等高线光谱图,共振光散射瑞利散射,固定ex=270nm,拉曼光,二级共振光散射,三级共振光散射,三.分子荧光(磷光)强度与荧光物质浓度的关系,1.荧光强度(磷光)与浓度的关系,光吸收定律（Lambert Beer Law）,相应的吸光分数为：,荧光强度（IF）与相应的吸光分数成正比：,按照级数展开式：,对于稀溶液，当 bc0.05（磷光 bc0.01）时：,IF-荧光强度F-荧光量子产率,k-与仪
13、器灵敏度有关的参数I0-入射光强度。,IP-磷光强度P-磷光量子产率,b-吸收光程-摩尔吸光系数C-荧光物质浓度,2.荧光(磷光)的平均寿命,分子在激发态的平均时间或者说处于激发态的分子数目衰减到原来的1/2所经历的时间。对于处于S1(T1)电子态的荧光体来说，其平均寿命()可以左式表示：,3.荧光(磷光)的量子产率,荧光量子产率的定义：,kF、kp主要取决与荧光物质的分子结构；st系间窜跃效率。ki主要取决化学环境，同时也与荧光物质的分子结构有关。,大多数的荧光物质的量子产率在0.11之间；例如：0.05mol/L的硫酸喹啉，F=0.55；荧光素 F=1,1.跃迁的类型,二.荧光与有机化合物
14、的结构,对于有机荧光物质:,*,n*max 100 平均寿命10-510-7sec,*max104 平均寿命10-710-9sec kS T小,*n,*是有机化合物产生荧光的主要跃迁类型。,强荧光的有机化合物具备下特征:具有大的共轭键结构；具有刚性的平面结构；具有最低的单重电子激发态为S1为*型；取代基团为给电子取代基。,7.2 分子荧光与磷光强度的影响因素,一.荧光的量子产率分子结构和发光分子所处的环境,2.共轭效应,产生荧光的有机物质，都含有共轭双键体系，共轭体系越大，离域大键的电子越容易激发，荧光与磷光越容易产生。,荧光物质的刚性和平面性增加，有利于荧光发射。,3.刚性平面结构,芴,联苯
15、,F=1,F=0.2,不产生荧光,产生荧光,产生荧光,不产生荧光,F=0.92,萘,VA,F(萘)=5F(VA),荧光黄,酚酞,偶氮菲,偶氮苯,1）给电子取代剂加强荧光,4.取代基效应,HN2，NHR，NR2，OH，OR，CN,产生 p 共轭,二苯甲酮：弱荧光、强磷光S1 T1的系间窜跃产率接近1,2）得电子取代基减弱荧光、加强磷光,C=0，COOH，NO2,不产生 p 共轭,硝基苯：不产生荧光、弱磷光,空间位阻对荧光发射的影响,3）取代基的位置,反式二苯乙烯强荧光物质,F=0.75,F=0.03,立体异构体对荧光发射的影响,顺式二苯乙烯非荧光物质,电离效应对荧光发射的影响,pH=1,有荧光,
16、pH=13,无荧光,无荧光,有荧光,含有重原子的溶剂，由于重原子效应荧光减弱、磷光增强。,5.重原子取代基效应,Cl，Br，I,S1 T1的系间窜跃由于重原子的存在增强,6.溶剂效应,蓝移:E n*E n*,红移:E*E*,在极性溶剂中：,无溶剂化作用,有溶剂化作用,三.金属螯合物的荧光,1.螯合物中配位体的发光,2.螯合物中金属离子的发光,8-羟基喹啉弱荧光,8-羟基喹啉-Zn螯合物黄绿色强荧光,2,2-二羟基偶氮苯无荧光,2,2-二羟基偶氮苯-Al螯合物强荧光,T1,系间窜跃,d*d f*f 荧光,分子内能量转移,三、影响荧光强度的环境因素,1.溶剂的影响 除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢
17、键、配位键的形成都将使化合物的荧光发生变化；2.温度的影响 荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几率增加。3.溶液pH 对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制；,4.内滤光作用和自吸现象,自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。,内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾；,5.溶液荧光的猝灭,荧 光 熄 灭：荧光分子与溶剂分子或其它溶质分子相互作用引起荧光强度降低或消失的现象。荧光熄灭剂：这些溶剂分子或其它溶质分子称为荧光熄灭剂。,1.碰撞熄灭,相对速率 1K1 M*K2 M*Q,与分子的
18、直径、粘度、温度等因素有关。,2.能量转移熄灭,再吸收过程：,共振能量转移：,分子内能量转移：,激发发射熄灭,3.氧的熄灭作用,氧分子是荧光、磷光的熄灭剂，,4.自熄灭与自吸收,当荧光物质的浓度大于1g/L时，常发生荧光的自熄灭(浓度熄灭),自吸收：,没有除氧，溶液中难以观察到磷光,由于F 1，使荧光强度减弱或消失.,形成二聚体：,由于二聚体不发荧光，或发射荧光的能量有改变，造成自熄灭现象。,7.3 荧光(磷光)分光光度计,一.主要组成及部件的功能,荧光分光光度计工作原理基及仪器结构框图,光源,氙灯,激发单色器,样品池,光电倍增管,数据处理仪器控制,发射单色器,问题：荧光分光光度计与紫外-可见
19、分光光度计有何异同点？,二.光源,1.光源的要求：,发射强度足够且稳定的连续光谱光辐射强度随波长的变化小有足够长的使用寿命,2.氙灯光源,常用气体放电灯类型：氙灯光源 高压汞光源,波长范围：2001000nm工作压力：520 atm启动电压：2040KV使用寿命：10002000h,最广泛应用的连续光源：发射波长范围宽 发射光强度大,3.高压汞灯光源,应用广泛的线光源：253.7 296.5 302.2 312.6313.2 365.0 365.5 366.3404.7 435.8 546.1 557.0579.0(nm),玻璃滤光片的透射率,干涉滤光片的透射率,截止涉滤光片的透射率,三.单色
20、器,平面衍射光栅,线色散率,聚光本领,分辨率,四.检测器,光电倍增管 放大倍数：2n5n;n=10,103107，最大108109,五.样品池：液池、荧光池,1.样品池的材料：与紫外-可见分光光度计的吸收池一样,2.吸收池的形状：紫外-可见分光光度计的吸收池两面透光 荧光分光光度计的样品池四面透光,波长范围,3.使用注意事项,容易破碎,问题：紫外-可见分光光度计的吸收池与荧光分光光度计的样品池有什么区别？,沾污问题,闪跃特性,六.磷光分光光度计,1.光学系统与荧光分光光度计的区别,共振荧光：10-12 sec,荧 光：10-8 sec,磷 光：110-4 sec,迟滞荧光：10010-4 se
21、c,2.样品池与荧光分光光度计的区别,通常情况下，样品池需要放在盛液氮的石英杜瓦瓶内，来测定低温磷光。,7.荧光分析法的应用,一.工作曲线法,荧光分析的灵敏度比紫外可见分光光度法高103104.,荧光熄灭工作曲线法,直接荧光标准曲线法,二.荧光分析法的灵敏度,在紫外光照射下会发生荧光的无机化合物很少，主要依赖于有机试剂形成的螯合物。,三.荧光分析的应用,1.无机化合物,直接荧光测定法,其中，较常测定的元素有：Be、Al、B、Ga、Se、Mg、Zn、Cd与某些稀土元素；测定的灵敏度有些可以达到10-10;,某些元素虽然不与有机试剂形成发荧光的配合物，但是它会与发荧光的配合物争夺配位体，组成不发荧
22、光的配合，使其产生荧光熄灭，由荧光熄灭的强度计算该元素的含量。较常测定的元素有：F、S、Fe、Ag、Co、Ni、Cu、Mo、W,荧光熄灭测定法,自从1867年Goppelsroder进行了历史上首次的荧光分析工作，应用铝桑色素配合物的荧光进行铝的测定以来，采用有机试剂可以测定70多种元素。,催化荧光测定法,较常测定的元素有：Cr、Nb、U、Te、Pb,某些元素虽然与有机试剂形成发荧光的配合物，但是反应速度慢，在某些微量元素的催化下，反应速度会加快，在特定的时间内可用来测定微量元素。,低温荧光测定法,常测定的元素有：Cu、Be、Fe、Co、Os、Ag、Au、Zn、Al、Ti、V、Mn、Er、H2
23、O2、CN,某些微量元素存在，会催化发荧光的配合物产生荧光熄灭，在特定的时间内可用来测定微量元素。,溶液温度的降低，显著增强溶液的荧光强度。液氮 1960C,较常测定的元素有：Ce、Sm、Tb 等稀土元素Sb、V、Pb、Bi、Nb、Mn,固体荧光测定法,固体荧光法在荧光分析中也经常用到。,芳香族化合物存在共轭的不饱和体系，是有机化合物荧光测定的主要类型。,.有机化合物,3.生命与生物物质,紫外-可见分光光度计:,荧光(磷光)分光光度计:,紫外-可见分光光度计测量池(吸收池),荧光分光光度计样品池,I0,It,I0,It,IF,p,7.5 化学发光分析,一、基本原理,1.化学发光反应 在化学反应
24、过程中，某些化合物接受能量而被激发，从激发态返回基态时，发射出一定波长的光。A+B=C+D*D*D+h（1）能够发光的化合物大多为有机化合物，芳香族化合物；（2）化学发光反应多为氧化还原反应，激发能与反应能相当 E=170300 kJ/mol；位于可见光区；（3）发光持续时间较长，反应持续进行；化学发光反应存在于生物体(萤火虫、海洋发光生物)中，称生物发光(bioluminescence)。,2.化学发光效率,化学效率：,发光效率：,时刻t 的化学发光强度(单位时间发射的光量子数)：,dc/dt 分析物参加反应的速率；,3.化学发光强度与化学发光分析的依据,在化学发光分析中，被分析物相对于发光
25、试剂小得多，对于一级动力学反应：,dc/dt=Kc；K 为反应速率常数。定性依据：（1）在一定条件下，峰值光强度与被测物浓度成线性；,（2）在一定条件下，曲线下面积为发光总强度(S)，其与被测物浓度成线性：,4.化学发光反应的类型,（1）气相化学发光反应a.一氧化氮与O3的发光反应 NO+O3 NO2*NO2*NO2+h 发射的光谱范围：600875nm，灵敏度1ng/cm-3；b.氧原子与SO2、NO、CO的发光反应 O3 O2+O（1000 C石英管中进行）SO2+O+O SO2*+O2 SO2*SO2*+h 最大发射波长：200nm；灵敏度1ng/cm-3；,O3 O2+O（1000 C
26、石英管中进行）NO+O NO2*NO2*NO2+h 发射光谱范围：4001400nm；灵敏度1ng/cm-3；氧原子与CO的发光反应：CO+O CO2*CO2*CO2+h 发射光谱范围：300500nm；灵敏度1ng/cm-3；,氧原子与NO的发光反应：,c.乙烯与O3的发光反应,乙烯与O3反应，生成激发态乙醛：,CH2O*CH2O+h 最大发射波长：435nm；对O3的特效反应；线性响应范围1 ng/cm-3 1g/cm-3；,（2）火焰中的化学发光反应,在富氢火焰中，也存在着很强的化学发光反应；a.一氧化氮 NO+H HNO*HNO*HNO+h 发射光谱范围：660770nm；最大发射波长
27、：690nm；在富氢火焰中：NO2+2H NO+H2O 该反应十分迅速；,b.硫化物,挥发性硫化物SO2、H2S、CH3SH、CH3SCH3等在富氢火焰中燃烧，产生很强的化学发光（蓝色）：SO2+2H2 S+2H2O S+S 2S2*S2*S2+h 发射光谱范围：350460nm；最大发射波长：394nm；灵敏度：0.2 ng/cm-3；发射光强度与硫化物浓度的平方成正比。,（3）液相中的化学发光反应,机理研究较多，在分析中应用最多；可测痕量的H2O2、Cu、Mn、Co、V、Fe、Cr、Ce、Hg、Th等。应用最多的发光试剂：鲁米诺（3-氨基苯二甲酰肼）；化学发光反应效率：0.150.05；鲁
28、米诺在碱性溶液中与双氧水的反应过程：,该发光反应速度慢，某些金属离子可催化反应；利用这一现象可测定这些金属离子。,5.化学与生物发光分析的应用,（1）该发光反应速度慢，某些金属离子可催化反应；利用这一现象可间接测定这些金属离子。可测痕量的Cu2+、Mn2+、Co2+、V4+、Fe2+、Fe3+、Ni2+、Ag+、Au3+、Hg2+等（2）可检测低至 10-9 mol/L 的H2O2；（3）间接测定某些生物试样,氨基酸+O2 酮酸+NH3+H2O2,氨基酸氧化酶,葡萄糖+O2+H2O 葡萄糖酸+H2O2 通过测定生成的H2O2，确定氨基酸、葡萄糖含量。,葡萄糖氧化酶,草酸二酯(能量提供体)+高浓
29、度双氧水+稠环芳烃(能量接受体)+金属离子+溶剂组成的反应体系，可发出很强的可见光，发光效率高，使用不同的稠环芳烃，发射出不同颜色的光(冷光源)。,生物发光分析应用 1,在pH 78；荧光素酶(E)和Mg2+的存在下，荧光素(LH2)与磷酸三腺甙(ATP)的反应，生成磷酸腺甙(AMP)荧光素和荧光素酸的复合物和镁的焦磷酸盐(ppi)：,ATP+LH2+E+Mg2+AMP LH2 E+Mg ppi+2H+,pH7-8,复合物与氧反应，产生化学发光：,AMP LH2 E+O2 氧化荧光素*+AMP+CO2+H2O氧化荧光素*氧化荧光素+h最大发射波长562nm；,生物发光分析应用 2,烟酰胺腺嘌呤
30、二核苷酸(NADH)在细菌中的黄素酶作用下，在氧化型黄素单核苷酸(FMA)存在下，发生发光反应：,NADH+FMA+H+NAD+FMNH2,NADH脱氢酶,FMNH2+RCHO+O2 FMN+RCOOH+H2O+h,黄素酶,最大发射波长495 nm；,二、特点,1.灵敏度极高 例：荧光素酶和磷酸三腺甙(ATP)的化学发光分析，可测定210-17Mol/L的ATP，即可检测出一个细菌中的ATP含量2.仪器设备简单 不需要光源、单色器和背景校正；3.发射光强度测量无干扰 无背景光、散射光等干扰；4.线性范围宽5.分析速度快缺点：可供发光用的试剂少；发光反应效率低（大大低于生物体中的发光）；机理研究
31、少。,三、装置与技术,装置流程：,发光反应可采用静态或流动注射的方式进行：静态方式：用注射器分别将试剂加入到反应器中混合，测最大光强度或总发光量；试样量小，重复性差；流动注射方式：用蠕动泵分别将试剂连续送入混合器，定时通过测量室，连续发光，测定光强度；试样量大；,习 题,解释系列名词:(1)量子效率；(2)振动弛豫(3)系间跨跃在UV-VIS范围内，从原理上比较分子荧光、磷光和化学发光的异同，并比较它们的吸收现象。什么是荧光猝灭？举例说明怎么利用荧光猝灭来进行化学分析？在实际中，怎样区分荧光和磷光？比较荧光光谱法和化学发光光谱法的仪器特点。荧光光谱法的灵敏度一般要比吸收光谱法的灵敏度高，试解释其原因。通过下列方法能够改变荧光量子产率，并说明原因。(1)降低温度；(2)升高温度（3）改变荧光体的浓度(4)加入动态猝灭剂(5)加入静态焠灭剂(6)改变溶剂的黏度试说明为了获得荧光的:(1)激发光谱；(2)发射光谱；(3)同步荧光光谱；(4)三维荧光光谱，在实验上有哪些差别？为什么在高浓度条件下分子荧光校准曲线会变成非线性？,
