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1、第四章 目的基因的转化及其原理,第一节 植物基因工程载体及其构建,1,植物基因转化系统,载体转化系统（Ti质粒转化载体，Ri质粒转化载体）原生质体DNA直接导入转化系统基因枪DNA导入转化系统花粉粒介导转化系统,2,一、植物基因工程载体命名规则及种类,1、植物基因工程载体命名规则：(1)pSC101,plasmid,Stanley Cohen(人名),pTiT37/pAtT37,根癌农杆菌的质粒类型（Agrobacterium tumefaciens）,pRiT37/pArT37,发根农杆菌的质粒类型（Agrobacterium rhizogenes）,3,（2）每个基因位点均以三个斜体小写字
2、母表示，如：leu（亮氨酸基因位点）基因表现型用正体表示，如Leu（3）基因中任何位点发生突变则在该基因符号后加该位点斜体大写字母，如亮氨酸A、B位点分别为突变型或缺陷型，表示为：leuA、leuB(4)抗性和敏感性分别用R或r，S或s表示,4,2、植物基因工程载体的种类及特性,植物基因工程载体,克隆载体,中间载体,中间克隆载体,中间表达载体,卸甲载体,onc-,onc+,转化载体,中间黏粒载体,质粒/黏粒载体,基因标记载体,一元转化载体（顺式载体）,双元转化载体（反式式载体）,共整合载体,SEV（拼接末端载体；split-end vector）,5,二、根癌农杆菌Ti质粒的结构与功能,1、T
3、i质粒的遗传特性、结构及功能2、T-DNA的基因结构与功能3、Vir区操纵子的基因结构与功能,6,一、Ti质粒的遗传特性、结构及功能,1.Ti质粒的遗传特性及类型 Ti质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质，为双股共价闭合的环状DNA分子。根据其诱导的植物冠瘿瘤中所合成的冠瘿碱种类不同，Ti质粒可以被分成四种类型：章鱼碱型(octopine)胭脂碱型(nopaline)农杆碱型（agropine）农杆菌素碱型（agrocinopine）或称琥珀碱型(succinamopine),7,图3-1 章鱼碱型Ti质粒基因图。,8,2.Ti质粒的功能区域,Ti质粒可分为四个区：（1）T-DNA区（trans
4、ferred-DNA regions）：T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA，称为转移DNA。该DNA片段上的基因与肿瘤的形成有关。（2）Vir区（virulence region）该区段上的基因能激活T-DNA转移，使农杆菌表现出毒性，故称之为毒区。T-DNA区与Vir区在质粒DNA上彼此相邻，约占Ti质粒DNA的三分之一。,9,（3）Con区（regions encoding conjugations）该区段上存在着与细菌间接合转移的有关基因（tra），调控Ti质粒在农杆菌之间的转移。冠瘿碱能激活tra基因，诱导Ti质粒转移，因此称之为接合转移编
5、码区。（4）Ori区（origin of replication）该区段基因调控Ti质粒的自我复制，故称之为复制起始区。,10,3.Ti质粒的生物学功能,Ti质粒的功能可归为以下7个方面:参与寄主细胞合成植物激素吲哚乙酸（IAA）和一些细胞分裂素的活动。诱发植物产生冠瘿瘤并决定所诱导的肿瘤的形态学特征和冠瘿碱成分。赋予寄主菌株具有分解代谢各种冠瘿碱化合物的能力。赋予寄主菌株对土壤杆菌所产生的细菌素的反应性。为农杆菌提供附着于植物细胞壁的能力。决定寄主菌株的植物寄主范围。有的Ti质粒能够抑制某些根瘤土壤杆菌噬菌体生长与发育，即具有对噬菌体的“排外性”。,11,表4-1 Ti质粒放入部分基因及其功
6、能,12,二、T-DNA的基因结构与功能,1.T-DNA的发现 Chilton等人于1982发现。(MDCHILTON,D TEPFER,A PETIT,D CHANTAL,CD FRANCINE,T JACQUES.Agrobacterium rhizogenesinserts T-DNA into the genomes of the host plant root cells.Nature,1982(295):432-434）研究证明，这部分DNA是从质粒DNA上切割后，转移到肿瘤细胞，故称之为转移DNA（transferred-DNA）。,13,图3-2 Ti质粒上几个重要区域及其序列
7、,LB：左边界序列；RB：右边界序列,14,2.T-DNA的结构特点,lTi质粒T-DNA区的长度约为23kb；l T-DNA仅存在于植物肿瘤细胞的核DNA中；l 在T-DNA的5端和3端都有真核表达信号。如TATAbox、AATAAbox及polyA等。,15,T-DNA的两端左右边界各为25bp的重复序列，即边界序列（border sequence），分别称之为左边界（BL或TL）和右边界（BR或TR）。该25bp边界序列属保守序列,但通常右边界（TR）序列更为保守，左边界(TL)序列在某些情况下有所变化。其核心部分是14bp，可分为10bp(CACGATATAT)及4bp(GTAA)两部
8、分,是完全保守的。致瘤性：右边界作用大于左边界,16,3.T-DNA上的编码基因及功能,T-DNA的转录有下述共同点：T-DNA的两条链都是有意义链,即都能被转录。T-DNA上每个基因都有各自的启动子。基因的转录由植物细胞RNA聚合酶完成。T-DNA具典型的真核生物RNA合成起始和终止的调节信号，T-DNA的转录机理可能与真核生物相同。植物或农杆菌中可能有甲基化或去甲基化的调节基因活性。,17,TL,TR,TC,iaaH iaaM,aux,ipt,cyt,ocs,frs,mas,ags,图4-3 章鱼碱型Ti质粒的T-DNA编码基因结构,iaaH：吲哚乙酸胺水解酶；iaaM：色氨酸单加氧酶；a
9、ux：生长素；ipt:异戊烯基转移酶；cyt：细胞分裂素；frs：琥珀碱合成酶；mas：甘露碱合成酶；ags：农杆碱合成酶,18,T-DNA区基因的功能,第一类是编码冠瘿碱合成酶及分解代谢基因，如:frs、mas、ags 第二类是致瘤基因；包括生长素基因aux和细胞分裂素基因cyt,19,三、Vir区操纵子的基因结构与功能,1、Vir区操纵子的基因结构：农杆菌致瘤所必须的；Vir区仅位于T区DNA左侧；两者之间的距离常随Ti质粒类型不同而有差异。,H,A,B,G,C,D,E,F,tzs,A,B,G,C,D,E,章鱼碱,胭脂碱,图 4-5 章鱼碱型和胭脂碱型Ti质粒的Vir区编码基因结构,20,
10、表 4-4 章鱼碱型Ti质粒vir基因基本结构与功能,21,三、农杆菌Ti质粒基因转化机理,已知农杆菌附着到植物细胞后，只留在细胞间隙中。T-DNA首先在细菌中被加工、剪切、复制，然后转入植物细胞，并非整个Ti质粒都进入植物细胞。该基因转化过程是一个复杂的遗传工程。,22,1、T-DNA的加工及转移,23,四、T链整合植物基因组的分子机理,1、整合位点及其特性T-DNA在植物染色体中的插入是随机的，可插入植物任何一条染色体插入位点常有以下特点：T-DNA优先整合到转录活跃的植物基因位点；T-DNA与植物DNA连接处富含A，T碱基对；植物DNA上的插入靶位点与T-DNA边界序列有一定程度的同源性
11、。,24,2.T-DNA的整合机理,双链断裂修复模型（DSBR model）单链缺口修复模型（SSGR model）,25,Sci，IF：9.205,26,27,Fig 4-6 Illegitimate recombination models for T-DNA integration.(a)Double-strand break-repair(DSBR)and single-strand gap-repair(SSGR)models equally explain the integration events leading to T-DNA insertion 621-x34.As ou
12、tlined in the Discussion,the DSBR model predicts a double-strand break in the target.Unwound or exonuclease processed ends of the T-DNA and of the target anneal by partial homologous pairing.Single-strand overhangs are removed by endo-or exonuclease digestion;the ends are repaired and ligated.The SS
13、GR model predicts a nick in the target that is converted to a gap by a 5-3 exonuclease.The T-strand invades the gap and a synapsis is formed by partial pairing between T-DNA ends and target.The overhangs of the T-DNA are removed and the T-strand is ligated to the target.A nick introduced into the se
14、cond strand of the target initiates repair synthesis of the second strand of the T-DNA.(b)Application of the SSGR model for T-DNA insertion 621-36.As proposed in the model of insertion 621-x34,repair at the ends of invading T-strand may occur before ligation.Absence of an internal CAGT T-DNA sequenc
15、e from the right junction of insert 621-36 suggests that copying of the target plant DNA led to alteration of the right T-DNA end during integration.Mismatch repair may similarly explain the observed deletion.(c)A modified version of SSGR model explaining possible involvement of VirD2 protein in rec
16、ombination events that resulted in T-DNA insertions 621-37 and N6H-cs4.T-DNA invasion depicted in the model involves VirD2-mediated recognition of a nick(or gap)that is followed by ligation of the 5 end of the T-strand to the target DNA.The 3 end of the T-strand moves along the target,while the unwo
17、und target DNA strand is removed by exonucleolytic digestion.At the position where the 3 end of the T-strand is stabilized by base-pairing,the T-strand is ligated to the target.At the same position a nick is introduced in the second strand of the target that defines the left break-point of target de
18、letion and initiates the replication of the T-strand.Symbols used for presentation of putative recombination events are explained underneath the models.,28,3.T-DNA整合的遗传效应,T-DNA插入的遗传特性：(1)T-DNA的插入不引起植物DNA大的重排。但多数插入会导致靶位点处小的缺失，缺失多至79个核苷酸。(2)另一个常见的结果是，在T-DNA植物DNA连接处，会有几个至33个核苷酸的“填充”DNA（Filler DNA）存在，这些
19、“填充”DNA的序列与靠近连接处的植物DNA序列相似。(3)在植物靶位处不要求有特异的序列，但若在T-DNA两端和植物靶位处之间有一段短序列（510b）同源，则可以在整合中起作用。,29,五、农杆菌Ti质粒的改造及载体构建,1、Ti质粒的改造及卸甲载体构建 2、中间载体/表达载体的构建 3、植物基因转化载体系统的构建,30,1、Ti质粒的改造及卸甲载体构建,野生型Ti质粒直接作为植物基因工程载体，存在如下障碍：Ti质粒分子量过大，一般在160240kb，基因工程中难以操作；大型的野生Ti质粒上分布着各种限制酶的多个切点，.难以找到可利用的单一限制性内切酶位点，不能通过体外DNA重组技术直接向野
20、生型Ti质粒导入外源基因；T-DNA区内含有许多编码基因，其中onc基因产物干扰宿主植物中内源激素的平衡，转化细胞长成肿瘤，阻碍细胞的分化和植株的再生；Ti质粒不能在大肠杆菌中复制,即使得到重组质粒，也只能在农杆菌中进行扩增；而农杆菌的转化率极低（10左右）,因此，通过Ti质粒的体外操作，在常规分子克隆条件下几乎不能构建在T-DNA中只有单一切点的载体；Ti质粒上还存在一些对于T-DNA转移不起任何作用的基因。,31,为了使Ti质粒成为有效的外源基因导入载体，必须对野生型Ti质粒进行一番科学的改造。十分幸运的是，大肠杆菌具有能与农杆菌高效地接合转移的特性。因此，科学家们可以先将T-DNA片段克
21、隆到大肠杆菌的质粒中，并插入外源基因，最后通过接合转移把外源基因引入到农杆茵的Ti质粒上，这是一种把预先进行亚克隆、切除、插入或置换的T-DNA引入Ti质粒的有效方法。带有重组T-DNA的大肠杆菌质粒衍生载体称为”中间载体”（intermediate vector），而接受中间载体的Ti质粒则称为受体Ti质粒（acceptor Ti p1asmid），一般是卸甲载体（disarmed vector）。,32,2、onc-卸甲载体,所谓卸甲载体就是无毒的（non-oncogenic）Ti质粒载体。因为利用野生型的Ti质粒作载体时，影响植株再生的直接原因是T-DNA中onc基因的致瘤作用。因此，为
22、了使野生型的Ti质粒成为基因转化的载体，必须切除T-DNA上的onc基因，即“解除”其“武装”,构建成所谓“卸甲”或称“缴械”载体（disarmed vector）。在这种onc-载体中，已经缺失的T-DNA部位被大肠杆菌的一种常用的质粒pBR322取代。这样任何适合于克隆在 pBR322质粒中的外源DNA片段，都可以通过与 pBR322质粒DNA的同源重组，而被共整合到Onc-Ti质粒载体上。,33,onc+卸甲载体,对于研究外源基因在转基因植株中的表达，以及对于以改良农作物为目的的植物基因工程而言，onc-体系是最有用的。不过，人们可能还要设计一些特殊的实验来研究外源基因在冠瘿瘤组织中的表
23、达问题。在这种情况下，使用onc+菌株载体则比较合适。由于冠瘿瘤组织具有不依赖于激素的表型特征，所以这种载体系统的优点在于它可以快速地增生冠瘿组织，比较快速而容易得到转化体。,34,2、中间载体的构建,（1）中间载体的基本结构与特点 为解决Ti质粒不能直接导入目的基因的困难，构建中间载体（intermediate vector）是有效方法之一。中间载体是一种在一个普通大肠杆菌的克隆载体（例如pBR322质粒）中插入了一段合适的T-DNA片段，而构成的小型质粒。中间载体通常是多拷贝的E.Coli小质粒，这一点对于通过体外遗传操作导入外源基因是非常必要的。从结构特点看可分为两类中间载体，即共整合系
24、统中间载体和双元载体系统中间载体。,35,共整合系统中间载体的特征,中间载体必须含有与Ti质粒T-DNA区同源的序列，此外含有pBR的序列，在其被引入到根癌农杆菌后即可高频地与Ti质粒的T-DNA的同源序列进行重组；它应具有一个或几个细菌选择标记，这将有利于筛选共整合质粒；它必须 有bom位点，在有诱导质粒存在的情况下，bom位点的存在可以使中间载体在不同细菌细胞内进行转移；它应该含有阳性植物选择标记，以利于转化植物细胞的筛选，例如新霉素磷酸转移酶(neomycin phosphotransferase,Npt-)基因，其可赋予转化植物细胞卡那霉素抗性；它应该含有单一的限制性内切酶切点，以利于
25、外源基因的插入；无Ti质粒的边界序列。,36,双元载体系统的中间载体,与共整合系统中间载体不同之处是:无同源序列；具有LB和RB;无Co1E1复制点,37,（2）中间表达载体,启动子及其它调控序列 转录的调控对真核生物基因表达起着关键性作用。就真核生物基因表达调控序列而言，大多数真核生物在转录起始点的5端上游区第30至25bp处具有TATA盒，在70至 80bp处还有CAAT盒。在大多数真核生物基因的3端具有AATAA序列。这些5和3端的调控序列对真核生物的基因表达起着关键性作用。Ti质粒虽然来源于农杆菌，但其Nos、Ocs、Tmr等基因具有与真核生物启动子类似的TATA盒和CAAT盒，均能在
26、植物细胞中表达，并且无组织特异性。因此，它们成为早期构建嵌合基因的启动子，其中以Nos启动子（pNos）最常用。,38,39,3、植物基因转化载体系统的构建,（1）一元载体系统（2）双元载体系统,40,1一元载体系统的构建,这一类载体是中间表达载体与改造后的受体Ti质粒之间，通过同源重组所产生的一种复合型载体，通常亦称为共整合载体（co-intergrated vecter），又由于该载体的T-DNA区与Ti质粒Vir区连锁，因此又称之为顺式载体（cis-vector）。一元载体的特点是:由两个质粒（E.coli质粒和Ti质粒）重组而成，分子量较大；共合体的形成频率与两个质粒的重组频率有关,相
27、对较低；必须用Southern杂交或PCR对大的共整合体质粒进行检测；构建时比较困难。一元载体系统目前主要有两种载体：共整合载体和拼接未端载体（split-end vector,SEV）。,41,（1）共整合载体的构建,共整合载体的特点是：中间表达载体与受体Ti卸甲载体，通过同源重组共整合而构建；中间表达载体与受体Ti质粒之间同源序列是pBR322。共整合载体的构建过程 l）中间载体pLGV1103导入农杆菌:目前通常采用两种方法，即接合转移法（conjugative transfer）和三亲杂交转移法。2）中间载体与受体Ti质粒的同源重组。3）共整合载体的选择。,42,共整合转化程序,（2）
28、SEV的构建,SEV系统即T-DNA边界拼接系统，亦称拼接末端载体（sp1it-end vecter,SEV）。它是由Freley等人于1985年建立的另一种共整合载体，也因为它的两个LIH序列在同源重组前分别处于不同质粒上而得名。SEV与pGV3850的差异及构建过程如下述：1）SEV的受体Ti质粒的T-DNA上的致瘤基因（onc）及TR都已被缺失，T-DNA的保留部分被称为“左边界内部同源区”（1eft inside homcology，LIH）。该受体Ti质粒还保留了Vir基因及其它正常的功能基因，同时还携有用于细菌筛选的抗性基因。2）SEV中间载体具有一个细菌的抗性基因，一个植物抗性基
29、因及与受体Ti质粒同源的LIH序列及TR。3）通过三亲杂交将中间载体导入农杆菌后，由于它们之间都具有LIH同源序列，即可发生同源重组，形成SEV的共整合载体。,44,（3）SEV与pGV3850比较,两者都是通过受体Ti质粒与中间载体同源重组而形成，故同属于共整合的一元载体系统，但它们之间有着一定的差异：1）它们的受体Ti质粒与中间载体的结构不同。pGV3850的左右边界在一个受体Ti质粒上，而SEV来自二个质粒，即TR来自中间载体。2）同源序列不同。pGV3850重组的同源序列是pBR322，而SEV是LIH。3）SEV是更有效的共整合载体。由于pGV3850共整合载体，带有大肠杆菌pBR3
30、22序列，外源基因嵌合在该序列中，因而转化的植物中也带有重复的pBR322序列。此重复序列可能对转化植物中的外源基因的稳定性有影响，而SEV系统则排除了这种可能。,45,2双元载体系统,双元载体（binary vecter）系统是指由两个分别含T-DNA和Vir区的相容性突变Ti质粒构成的双质粒系统,又因为其T-DNA与Vir基因在两个独立的质粒上，通过反式激活T-DNA转移,故称之为反式载体（trans vecter）.,46,（1）双元载体系统的构建原理,双元载体主要包括两个Ti质粒，即微型Ti质粒和辅助Ti质粒。Ti质粒上的Vir基因与T-DNA具有反式互补作用，Vir基因可以反式激活T
31、-DNA的转移。其次，中间载体含有广泛寄主范围质粒的复制起始点（oriV），而代替了共整合载体中用以重组的同源区，能够在任何农杆菌寄主里自发复制。,47,（4）双元载体的构建,将Mini Ti质粒转入含有He1per Ti质粒根癌农杆菌的途径有两条，一条是直接用纯化的Mini Ti质粒转化速冻的根癌农杆菌感受态细胞；另一条是与共整合载体构建一样，采用三亲接合的方式。Mini Ti质粒均能以E.coli的pRK2013为辅助质粒，通过三亲杂交而接合转移到含有辅助Ti质粒的农杆菌细胞内。由于E.coli的pRK2013不能在农杆菌中复制最后消失，含有Mini Ti质粒和He1per Ti质粒的根癌
32、农杆菌可直接用于植物细胞的转化。,48,49,（5）一元载体系统和双元载体系统的比较,双元载体系统与一元载体系统之间有着较大的差异：1）双元载体不需要共整合过程，因此系统中的两个质粒不必含有同源序列。2）Mini-Ti质粒具有E.coli质粒的复制位点、能在农杆菌的寄主中复制，使其质粒的拷贝数增加10100倍，而且Mini-Ti质粒分子量小（10kb），可以直接进行体外遗传操作。3）双元载体不需经过两个质粒的共整合过程，因此构建的操作步骤比较简单。4）由于mini-Ti质粒较小，并无共整合过程，因此质粒转移到农杆菌比较容易，而且构建的频率较高。,50,（5）一元载体系统和双元载体系统的比较,5
33、）由于根癌农杆菌感染的寄主范围是由Vir基因及染色体上的基因决定的，因此，使用双元载体系统更便于根据转化材料的来源不同选择适宜的He1per系统。6）双元载体在外源DNA转入植物细胞前，无需进行同源重组，插入载体的外源基因变异可能要比pGV3850系统来得小。7）共整合载体系统比双元载体系统更难以应用，通常一个共整合载体在用于植物转化之前，应弄清Ti质粒的拷贝数和大小，所以必须通过southern杂交来鉴定。8)共整合载体的重组频率很低，而双元载体系统的两个质粒接合的频率较高，一般至少高4倍，因此双元载体的构建频率较高。9）共整合载体构建成功后，工程菌的稳定性较好，双元载体稳定性较差，容易丢失
34、。10）双元载体在外源基因的植物转化中效率高于共整合载体。,51,载体构建中常用的选择标记及报告基因,选择标记基因和筛选标记基因必须具备以下四个条件：编码一种不存在于正常植物细胞中的酶；基因较小，可构成嵌合基因；能在转化体中得到充分表达；检测容易，并且能定量分析。选择标记基因和筛选标记基因差异：选择标记基因的功能主要是该基因的产物给予植物细胞产生一种选择压力，致使未转化细胞不能生长、发育与分化。而转化细胞对该标记产生抗性，不影响其生长等，从而将转化细胞选择出来，例如，Cat（氯霉抗性基因）。筛选标记基因强调给转化细胞带上一种标记，起报告和识别作用，故称报告基因。,52,1选择标记的应用,选择标
35、记的功能是在选择压力下把转化体选择出来。为达到这一目的，首先要在选择培养基中加入选择剂，产生一种选择压力，致使未转化细胞不能生长、发育。其次是选择标记基因的产物对选择剂产生抗性，致使转化细胞不受选择剂的影响，能正常生长、发育、分化，从而把转化体选择出来。近年来已研究出较多的选择标记基因。在选择标记的使用中值得注意的是标记基因的正确选择。没有一种标记在所有的植物全都行之有效；不同的标记基因对转化细胞的生长发育及转化率有着明显的影响；即使是同一种标记基因，在不同的选择抑制剂压力下也是不同的；不同的植物种类对选择系统的敏感性程度差异很大。因此，当试图转化一种新的植物时，设计许多种可替代的选择标记是有
36、利的。选择系统必须突出对相关植物组织的约束性选择压力，要随选择的靶外植体或组织而异。,53,表4-5 植物转化的遗传选择标记,54,2报告基因的应用,1、对在选择剂条件下再生的植株或组织乃至细胞都要进一步的筛选确定其是否属于真正的基因转化体。2、在转化系统中通过瞬时表达检测来确定转化是否成功，或检测转化的基因是否能在转化细胞中得到表达，因此起到报告的作用，故亦称之为报告基因（report gene）。3、用于启动子表达特性的评估和亚细胞区问的研究分析等。,55,3选择标记和报告基因的选择策略,上述选择标记和筛选标记的基因产物，按其性质特点可分为三大类型：抗生素类标记、生化类标记及荧光素类标记。这些标记基因必须正确使用，总体来说要注意以下几个原则：（1）不同的植物种类对选择系统的敏感程度差异极大；例如，Km抗性已在许多植物中被成功地用作可选择的标记，但有时对其他植物则无效。其无效的原因有两个方面：一方面由于产生对该化合物的高水平的耐受性；另一方面是在植物组织上形成枯斑病而坏死。（2）标记基因化合物的有效作用可能随被选择的靶外植体或组织而异，例如分化水平、外植体的类型（原生质体、单细胞、细胞群体、胚状体、愈伤组织、离体的根、茎、叶）、大小等都会影响任何一个标记基因的使用。（3）在众多的选择标记中，Km抗性基因已证明是一个很有用的转化选择标记。,56,
