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1、第四章 目的基因的获得,目的基因,准备要分离、改造、扩增或表达的基因。,一、基因的基本结构特征,一个能转录、翻译的结构基因依次包括以下几部分：转录启动区、核糖体识别区、编码区(包括起始密码子ATG、开放阅读框、终止密码子TAG、TAA或TGA)和转录终止区。,（一）原核生物基因的组成操纵子启动子：RNA聚合酶识别、结合和开始转录的片段；SD区：糖体16S rRNA识别、结合mRNA的位置；转录终止子和终止因子：分别指基因或操纵子3 端提供转录终止信号的DNA序列；协助mRNA聚合酶识别终止信号的辅助蛋白。原核的终止子在终止点之前有一回文结构，转录物形成茎环发夹。,基因区：ATG+extrons
2、+introns+TAA（TGA或TAG）转录启动区：编码蛋白的启动子(RNA聚合酶识别)可寻找三个保守区：TATAA/TA区（Hogness框）、CAAT框、GC框。转录终止区:真核生物转录的终止信号并不清楚。,（二）真核生物基因的组成,二、目的基因的获得方法,目前克隆目的基因常用的方法有四种方法：化学合成法、cDNA文库法、PCR法和RT-PCR法。,将已知序列的目的基因利用化学合成的方法直接合成。特点：只能合成小于100个碱基特定序列；自动化程度较高；合成速度较快。方法：磷酸二酯法、磷酸三酯法、固相亚磷酸三酯法,（一）化学合成法,化学合成法的用途,合成天然基因：如生长激素释放抑制素基因、
3、脑啡肽基因、胰岛素基因、干扰素基因等修饰改造基因：如组织型纤溶酶原激活剂基因、尿激酶原基因等设计新型基因制备探针、引物、接头,（二）cDNA文库法,cDNA(complementary DNA，互补DNA)：由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经体外反转录后形成的互补DNA。cDNA文库：利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增，称cDNA文库。,基因组DNA文库,cDNA文库,基因组DNA文库与cDNA文库的比较,构建cDNA文库的一般步骤,总RNA（total RNA）提取提取总RNA有商业化的试剂盒（kit）。mRNA约
4、占总RNA的15，所以应选用目的基因mRNA表达最丰富的组织细胞为材料来源，如获胰岛素基因，由应以胰岛细胞为原始生物材料，细胞因子基因应选用经抗原或丝裂原刺激培养的淋巴细胞为材料,2.mRNA的分离纯化,原理：利用mRNA都含有一段polyA尾巴，将mRNA从总RNA（rRNA、tRNA等）中分离纯化。方法：亲和层析。分离mRNA用商业化的Oligo dT纤维柱。,3.cDNA第一链的合成,Oligo dT法：用Oligo dT作引物，合成cDNA的第一链。,不适用于大分子量的mRNA,随机引物法：随机合成6-10bp的多种引物，从mRNA的多个位点开始合成cDNA。基因特异性引物法：mRNA
5、序列已知，设计基因特异性引物，在反转录酶的作用下合成cDNA第一链。,4.降解mRNA模板,用碱处理或用RNaseH降解mRNA-DNA杂交分子中的mRNA。,5.cDNA第二链的合成,自身引导法用RnaseH 消化后，cDNA单链的3末端一般形成一个弯回来的双链发卡结构（机理不明），可成为合成第二条cDNA链的引物。用DNA聚合酶合成第二链DNA。,S1核酸酶消化会使获得的双链cDNA 5端有几对碱基缺失,置换合成法 以第一链合成产物cDNA-mRNA杂交体作为切口平移的模板，RNA酶H在杂交体的mRNA链上造成切口和缺口,产生一系列RNA引物，在DNA聚合酶I的作用下合成cDNA的第二链.
6、,置换合成法,6.cDNA与载体连接,在双链cDNA末端接上人工接头，即可与载体连接，转入受体菌。或借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3端分别加上几个C或G，成为粘性末端。,cDNA文库的查询,用目的基因探针与文库中的重组载体进行Southern blot杂交。,（三）PCR法,目前实验室最常用。扩增时容易突变：高保真的PCR引物，DNA序列测定。,1.直接从基因组中扩增,提取基因组DNA作模板；根据目的基因序列设计引物；PCR扩增。适合扩增原核生物基因。,原核基因组部分,原核细胞,提取基因组DNA,PCR扩增,2.从mRNA中扩增:RT-PCR,提取基因组总RNA；反转录合成总cDNA作模板；根据目的基因序列设计引物；PCR扩增。适合扩增真核生物基因。,目的基因 的引物1,反转录成目的基因cDNA第一链,目的基因 的引物2,目的 基因cDNA第二链,PCR,mRNA,获取目的基因方法的选择策略,
