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1、器材准备,浓汁标本1支，粪便标本1支；碘酒棉球1瓶，酒精棉球1瓶，眼科镊子2把；伊红美兰平板2个，营养琼脂平板5个。,自然界中的微生物,已经发现的微生物超过13万5千种，被认为非常危险的有600种，在人间传染的病原微生物380种。它们存在于地球的各个角落，从寒冷的极地到炎热的赤道，从4.2千米地层深处到85千米高空（芽孢）,均有它们的踪迹。空气、水、土壤、人体的体表以及与外界相通的腔道，均有不同种类和数量的微生物存在。存在于人体消化道的细菌超过800种，数量可达100万亿（1014），菌体重量11.5公斤。,医学微生物学实验综合性实验三 Comprehensive Experiment NO:
2、3,Environmental flora and Normal Bacterial flora on Skin空气的细菌学检查P38手指皮肤的细菌学检查P41,空气的细菌学检查,空气是人类赖以生存的环境之一，也是重要的疾病传播媒介。空气中的病原菌主要来自病人的排泄物和分泌物。这些污物，因风吹，以及人类日常活动，以气溶胶的形式悬浮于空中，使空气受到污染。环境：不利于微生物生长。种类：主要是病毒、真菌和细菌。在医院，公共场所致病菌的数量比较多。作用：可迅速全球传播。危害：引起培养基、生物制品的污染，病原菌引起呼吸道传染病。,实验方法(自然沉降法):根据空气中细菌气溶胶粒子，在地心引力的作用下，以
3、垂直的自然方式沉降到培养基表面，培养以后，计数菌落形成单位（colony forming unit，CFU），可了解空气的污染情况。实验步骤：每组1个营养琼脂平板，选择采样地点（实验室、卫生间或任选地点），将平板盖打开，盖朝下放置在平板旁边，平板暴露于空气中15分钟，然后平板倒扣盖上，作标记。37温箱培养24小时，观察结果。CFU/m3 50000NAT86N(直径7cm平板）。N：平板上的菌落数。A：平板面积(平方厘米)。T：采样时间(分钟)。,平板盖打开，盖朝下放在平板旁边，平板暴露15分钟。,空气的细菌学检查 暴露法（Exposure Method),手指皮肤的细菌学检查P41,在日常生
4、活中，手的接触范围广，使用频率高，受到污染的机会也最多。一只外观比较“干净”的手，可携带10万个细菌、200多种病毒。经手传播的疾病，包括肠道传染病、部分呼吸道传染病、皮肤传染病，以及一切可经手传播的疾病。常住菌：存在于皮肤表面、毛囊和皮脂腺。种类和数量比较恒定。附着在皮肤上比较牢固，用一般洗手方法，常不易去除。暂住菌：存在于皮肤表面经常暴露的部位。暂住菌是外来的非正常菌群，种类和数量不定。引起人类致病的通常是暂住菌。,常规的洗手方法（甲和丙操作）,将手充分浸湿，涂抹肥皂或洗涤液。反复搓揉双手，搓揉时间不少于 30秒。用流水冲洗干净，整个洗手过程不少于1分钟。能有效地去除大多数暂住菌。,医学微
5、生物学教学实验室标准洗手方法（乙和丁操作）,用流动的水冲洗，将手充分浸湿，涂抹肥皂、洗涤液。分别搓擦1015次。保持双手低于肘部，流水冲洗一分钟以上。,1.掌心对掌心搓擦 2.手指交错掌心对手背搓擦 3.手指交错掌心对掌心搓擦,4.两手互握互搓指背 5.拇指在掌中转动搓擦 6.指尖在掌心中搓擦,手指皮肤的细菌学检查,甲和乙、丙和丁共用1个平板,上:甲、丙常规洗手下:乙、丁标准洗手,第1格为洗手前，第2格为洗手后，第3格为消毒后，第4格空白对照。,在培养基表面触摸23厘米,脓汁和粪便标本中病原菌的检测实验流程(6次课12学时）,培养基的制备,细菌的分离培养,细菌的纯培养,细菌的形态学检查,细菌的
6、生化试验等,细菌的血清学试验、结果分析实验论文撰写,平板划线分离法 Streak Plate Method,借助于划线，将混杂的多种细菌，在平板表面分散成单个细菌，并固定在某一点上。培养以后细菌各自分裂繁殖，形成肉眼可见的细菌集团（单菌落）。Colony:在固体培养基表面或基内，由单个细菌在局部位置不断增值，形成肉眼可见的细菌集团，称为单菌落。Colony Forming Units:由单个或聚集成团的多个菌体，在固体培养基上生长繁殖堆积形成肉眼可见的细菌集落，称为菌落形成单位。Lawn:在固体培养基表面，由许多菌落融合在一起形成一片密集的的细菌群落,称为菌苔。方法:见下一张幻灯片。充分利用平
7、板面积，不能划破琼脂。,划线示意图,分离结果,接种环烧灼灭菌。,取标本36ul。,平板采光，当看到平板表面象镜面有反光的时候，保持这个角度，划线时就能看清划线痕迹，以便控制划线。,接种环与平板呈3040度角，在平板表面上方，以曲线的形式，作大幅度来回连续划线，边划边退，线段要划得长而密集，每区划线不少于30条。,烧掉接种环上多余的标本。,转动平板，通过第一区57次，使接种环重新沾上少量细菌，同样的方法划第二区。,转动平板，接种环通过第二区1次，划第三区。,转动平板，接种环通过第三区1次，划第四区。,划第五区。,每区划线不少于30条，整个平板划线不少于150条线。上下两条线重叠不影响分离结果。第
8、一区划线不得超过1/5平板，,第一区占1/2平板，划线稀疏，没有典型单菌落。,第一区划线正确。第二区?第三五区？,划线分离失败！,划线分离成功,平板上有许多典型单菌落可供挑选。,线段划得越密集，细菌分布前区密集后区稀疏，获得典型菌落越多。,小组实验分工,甲脓汁标本(pus specimen)营养琼脂平板(nutrient agar plate)乙脓汁标本(pus specimen)营养琼脂平板(nutrient agar plate）丙粪便标本(stool specimen)伊红美蓝(eosin methylene blue plate）丁、戊粪便标本(stool specimen)伊红美蓝平
9、板(EMB plate）,甲 乙 4丙 丁,甲 乙 3丙 丁,甲 乙 2丙 丁,甲 乙 1丙 丁,甲 乙 5丙 丁,甲 乙 8丙 丁,甲 乙 7丙 丁,甲 乙 6丙 丁,甲 乙 10丙 丁,甲 乙 9丙 丁,讲 台,左,右,杆1214cm,环直径24mm,绝缘柄10cm,接种环 inoculating loop,杆1214cm,针长46cm,接种针 inoculatingneedle,Instruments used to inoculate media:standard loop,needle,cotton-tipped swab,and pipette with safety bulb.,
10、绝缘柄10cm,接种环（白金铒）烧灼灭菌 Flame Loop,使用前，将白金铒（白金丝、镍铬丝制成）直立火焰中，烧红灭菌（35秒钟冷却）。使用后，先在火焰背面将把环上标本烤干，再烧灼灭菌，以免标本汽化，爆烈四溅，污染环境。金属杆旋转通过火焰23次，杀灭表面微生物。,酒精灯无菌操作区,外焰:又称氧化焰,火焰呈淡紫色,温度较高。,无菌操作区:火焰周围1020cm范围内。,环面水平离开液面：快速6ul,慢速2ul。,环面垂直离开液面：快速3ul,慢速1ul。,接种环取液体标本的方法,环直径3mm,无菌取材基本步骤Transfer of Bacteria:Aseptic Technique,在火焰旁
11、边，左手斜持标本管下端，右手小指夹住试管棉塞上端，缓慢拔出棉塞并夹持之（棉塞下端不得接触到管口外任何物体）管口迅速通过火焰3次取标本管口通过火焰三次，塞棉塞。,Inoculating procedures,接种环和平板的握持方法How to hold agar plate and inoculation loop,生物安全警告,接种环接种平板一次，可产生几十个微生物气溶胶颗粒。气溶胶粒径100um沉降很快，50um在0.4s内扩散开，5um通过呼吸道直接到达肺泡。Pike博士对实验室感染统计分析结果发现，不明原因的感染高达82%，大多数是气溶胶在空气中扩散引起的。实验时应坐着，在火焰周围102
12、0厘米内操作，保持安静、有序，尽量少说话、少走动，以免感染病原菌。,三级生物安全防护,思考题,为何取链球菌作为空气的卫生指标之一?为什么金黄色葡萄球菌是医院内感染常见的重要病原菌?为什么接种环使用前后必须烧灼灭菌？忽略了有什么危害?做细菌培养时，平板为什么要倒置?培养细菌的常用方法有哪些?从临床标本中分离病原菌，应注意哪些事项?,实验内容,空气的细菌学检查P38营养琼脂平板(1组1个）手指皮肤的细菌学检查P41营养琼脂平板(2人1个 划分8格）平板划线分离法P8 甲脓汁标本营养琼脂平板乙脓汁标本营养琼脂平板丙粪便标本伊红美蓝平板丁粪便标本伊红美蓝平板,常用器材摆放顺序：电源插座试管架酒精灯污物盘。试管架上器材：靠近插座一侧第1列放置接种针,第2列放置接种环，另一侧中间两行放置油性笔和打火机。,器材使用后，必须放回原处，依次摆整齐。,实验器材 整齐有序,微生物学器材柜-2（边台东侧中段）,酒精棉球,碘酒棉球,镊子,电炉、石棉网,手套,消毒器材收拾入柜 依次摆整齐,
