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1、中药色谱指纹图谱操作规范与评价探讨,广州中医药大学中药学院,主 要 内 容,色谱指纹图谱的缘起、属性、特点和作用,中药色谱指纹图谱方法学,中药色谱指纹图谱试验的规范化,中药色谱指纹图谱的定性评价方法,应用实践,色谱指纹图谱的缘起、属性、特点和作用,中药质量控制现状,中国药典关于药材所收录的信息,齐墩果酸、熊果酸、大黄酸、槲皮素、小檗碱,目前中药质量控制的局限,缺乏化学对照品,化学对照品缺乏专属性,物质群体间的量化特征无法体现,中药整体的用药的特色无法体现,中药色谱指纹图谱的提出,中药依赖其所含的多种化学成份发挥疗效 任何单一的活性成份或指标成份都难以有效地 评价中药的真伪优劣 利用现代分析技术
2、分析不同中（成）药的整体 特征以提高鉴别的准确性 色谱指纹图谱分析（Chromatographic Fingerprint Analysis）梁逸增（中南大学）,中药色谱指纹图谱的特点及属性,中药指纹图谱同传统鉴别方法的区别在于：它不是从一个“点”，而是从一个二维的“面”（一个在特定条件下的完整色谱的整体特征信息）来鉴别真伪，同时在定量操作的前提下，得到“量”方面的信息还可以估量待测样品之间总体量的差别，从而从量的角度给以动态的质量评价。,色谱指纹图谱不强调个体的绝对唯一性，而强调统一药材群体的相似性，及物种群体内的唯一性,中药色谱指纹图谱的特点及属性,整体性,模糊性,对照样品与待测样品指纹图
3、谱的相似性，而不是完全相同,比较色谱的“完整面貌”，在不同环境的样品色谱中搜索和提取与该药材指纹图谱“面貌”相关的特征，加以区别,因此，中药色谱指纹图谱强调的是准确的辨认，而不是精确的计算,中药色谱指纹图谱方法学,反相高效液相色谱(RP-HPLC)Reversed Phase High Performance Liquid Chromatography,适用范围广分离性能好分析速度快流动相选择范围宽灵敏度高色谱柱可多次重复使用流出组分可以收集采用多种检测器，可同时获取保留值信息和化合物的光谱、值谱信息,对较为复杂的色谱实验条件要求比较苛刻，由此带来不同实验室之间重现性的难度增大,薄层色谱Thi
4、n Layer Chromatography(TLC),可在同板同时分析多达18个样品，时效高所用的是正相展开剂，其组成变化灵活，可适应多种成分的分离离线操作，即可直观比较图谱，又可扫描得到轮廓图和处理数据占机时间短具有色彩参数，可获得色彩丰富的色谱图像，直观性强；同时辅以功能团显色剂还可提示成分的类别，提高鉴别的专属性。,展距局限在10cm20cm，柱效相对较低，对复杂组分不提高分离度则难以提取指纹特征的药材受到限制。开放系统，对环境温度、相对湿度要求较高,气相色谱Gas Chromatography(GC),分离效能高分析速度快适用于植物的挥发油成分及其它易挥发性成分或可转化为可挥发的成分
5、测定可提供保留值信息，与质谱联用，还可提供更丰富的化学结构信息,分辨率高，得到的色谱组份非常复杂，尤其是含挥发油药材，单萜类成分组成很不稳定，样品间差异可能很大，处理数据和判别相似度时一定程度的取舍,毛细管电泳Capillary Electrophoresis,分离效能高分析速度快高分辨率可与紫外、荧光、电化学、质谱、拉曼光谱等联用，可提供更丰富的化学结构信息,14,2023/10/31,中药色谱指纹图谱试验的规范化,中药指纹图谱的建立,指纹图谱的获取,供试品的收集,真实性、代表性；收集量不少于 10 批,原料药材,半成品,成 品,供试品制备,对照品（参照物）,对照品（参照物）的作用 考察指纹
6、图谱的稳定程度和重现性 有助于指纹图谱的辨认,对照品（参照物）的选择 供试品种的活性成分或指标成分 指纹图谱中的稳定的指纹峰 内标物,对照品（参照物）溶液制备,色谱方法选择的原则,专属性 建立的指纹图谱必须能够表达该品种的特征 重现性 同一品种同一样品指纹图谱中构成指纹特征的各特征峰（或斑点）作为整体（峰位、峰数、峰的丰度、各峰的大致比例）在不同实验室和不同操作者之间得到的色谱整体特征应有较高的相似度 普遍适用性 色谱方法和实验条件应易于推广和便于操作,指纹图谱的实验研究,中药指纹图谱实验研究的基本要求,实验室基本要求 实验室应具备承担指纹图谱测定的总体能力 试验设备通过检验证明符合指纹图谱实
7、验研究的需要 技术人员具备从事指纹图谱实验研究的能力 对实验室的技术能力评价应由定期的内部独立检查 试验数据有可追溯，与其它实验室有可比性 实验室应有质量保证体系，以确保各种措施的透明与一致,仪 器 性能能够满足指纹图谱实验需要 需经校验,试验方法和试验条件优选的目的 选取相对简单易行的方法和条件，获取足以代表品种特征的指纹图谱，以满足指纹图谱的专属性、重现性和普遍适用性的需要,试验需考察的内容,液相色谱 色谱柱：比较试验加以选择,流动相：至少用三种不同组成比较,适宜的柱温和检测波长,薄层色谱,展开剂系统：至少需作三种进行比较,考察湿度和温度的影响,气相色谱 色谱柱：选择适宜色谱柱 升温程序设
8、定,样品的预处理,中药指纹图谱的方法验证,目的 考察和证明采用的指纹图谱测定方法具有可靠性和可重复性，符合指纹图谱的要求。,验证内容 专属性 准确度（结果准确度和系统准确度）精密度（重复性、中间精密度、重现性）范围 稳健性（耐用性）,专属性（Specificity）指纹图谱的测定方法对中药样品的分析鉴定能力,专属性的考察参数 峰纯度 总峰响应值 容量因子分布 最难分离物质对的分离情况 总分离效能 此外，还需评价有关样品（药材、中间体、制剂和相关产品）见的相关性，并尽可能显示出样品中特征响应,准确度（Accuracy）测定系统所的指纹图谱与“对照用指纹图谱”之间的相近程度,系统准确度 仪器的操作
9、指标与波动范围 样品在分析系统中的残留和对基线的响应 色谱分离情况（峰纯度、再现程度、峰型变化描述）指标成分的定量内容 结果准确度 多批次（10 批以上）样品测定结果的相似度,精密度（Precision）规定条件下对均质样品多次取样进行一系列检测结果有相近程度（离散度）,重复性（Repeatability）同样的操作条件下在较短的时间间隔的精密度 线性范围内至少测定 9 次或100的试验浓度下测定6次 中间精密度（Intermediate Precision）实验室内部条件改变测定的精密度 重现性（Reproducibility）不同实验室间的精密度,范围（Range）样品中被分析组分的较高浓
10、度和较低浓度的一个区间，并已证实在此区间内，该方法具有合适的准确度和精密度 相似度维持在0.9以上的浓度范围位指纹图谱测定范围,稳健性（Robustness）不同条件下分析同一样品所得结果的变化程度，是中药指纹图谱测定方法耐受环境变化的显示,指纹图谱实验操作规程,高效液相色谱指纹图谱实验操作规程 薄层色谱指纹图谱实验操作规程 气相色谱指纹图谱实验操作规程 毛细管电泳指纹图谱实验操作规程,36,2023/10/31,中药色谱指纹图谱的定性评价方法,中药指纹图谱整体评价方法面临的难题,?没有足够的标样，能否进行可靠的中药多组份的定性定量分析？能否建立起基于中药的色谱指纹图谱中要质量的评价标准？,?
11、如何对待色谱峰保留时间的漂移？,?如何对待色谱分析仪器的背景与基线的漂移？,?如何选取合适的内标化合物？如果难于选取，是否存在其他的方法来解决此问题?,?如何处理色谱图中大量的未知成分,中药指纹图谱的信息意义 表达中药复杂混合体系中各种不同化学成分浓度分布的整体状况,中药指纹图谱的标准建立与矢量相似度量原理,相关系数：反应的是变化趋势。比较各种波谱的相似程度时均采用该参数作为比较标准。相关系数在-1,1区间变化，当相关系数为1时，表示两个波谱完全一致；1时则波谱的变化趋势完全相反。,相合系数：0,1区间变化，当相合系数为1时，表示两个波谱完全一致；0时则一个指纹图谱中出现色谱峰的位置在另一个图谱中没有出现。,39,2023/10/31,国家药典委员会颁布，A版（研究版），B版（企业版）,色谱指纹图谱相似度评价软件,40,2023/10/31,应用实践,
