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1、,退出,酶工程Enzyme Engineering,第三章 酶的生物合成,第一节 产酶微生物概述第二节 微生物产酶的发酵工艺条件及控制第三节 植物细胞培养产酶的特性、工艺条件及控制第四节 动物细胞培养产酶的特性、工艺条件及控制,第一节 产酶微生物概述,一、微生物产酶的特点二、产酶微生物的种类三、微生物酶的种类四、产酶微生物的来源,一、微生物产酶的特点,工业生产酶制剂一般都以微生物为主要来源为什么酶制剂的生产主要以微生物为材料？(1)微生物种类多，酶种丰富，且菌株易诱变，菌种多样(2)微生物生长繁殖快，酶易提取，特别是胞外酶(3)来源广泛，价格便宜(4)微生物易得，生长周期短(5)可以利用以基因
2、工程为主的分子生物学技术，选育和改造 菌种，增加产酶率和开发新酶种,二、产酶微生物的种类,1、细菌2、放线菌3、酵母菌4、霉菌,1、细菌,1、细菌,1、细菌,2、放线菌,2、放线菌,3、酵母菌,4、霉菌,4、霉菌,4、霉菌,4、霉菌,三、微生物酶的种类,三、微生物酶的种类,1、蛋白酶催化肽键水解。可以在短时间内将蛋白质水解按蛋白酶作用的最适pH将其分为酸性、中性、碱性蛋白酶三类 2、糖化酶葡萄糖淀粉酶产酶菌种主要是霉菌最适反应pH为45，最适反应温度为5060,三、微生物酶的种类,3、-淀粉酶芽孢杆菌，米曲霉液体深层发酵，固体发酵 4、-淀粉酶芽孢杆菌、假单胞菌，土佐链霉菌、吸水链霉菌及高温放
3、线菌等多从高等植物中提取以微生物大规模生产，存在以下问题：酶活力低、耐热性差，不能适应啤酒、饴糖等工业生产,三、微生物酶的种类,5、葡萄糖异构酶木糖异构酶。能将D-木糖、D-葡萄糖、D-核糖等醛糖可逆地转化为相应的酮糖所有的异构糖全部使用固定化酶生产 6、果胶酶广泛存在于植物果实和微生物中工业上，常采用曲霉、青霉，枯草芽孢杆菌、欧氏杆菌等固态发酵，液体深层发酵水果加工，麻纤维脱胶，木材防腐，饲料添加剂等,三、微生物酶的种类,7、漆酶含铜的多酚氧化酶，最早从漆树的分泌物中发现广泛存在于担子菌、半知菌和子囊菌等高等真菌中，主要用的是白腐菌，至今只发现一种细菌能分泌漆酶降解木质素；与有毒的酚类物质作
4、用纸浆的生物漂白，污水处理，生态修复剂8、几丁质酶昆虫和大多数真菌的重要细胞结构成分细菌、放线菌、真菌等都可产生几丁质酶,三、微生物酶的种类,9、医药与分析研究用酶(1)青霉素酰化酶青霉素酰胺酶，青霉素氨基水解酶细菌、放线菌、霉菌及酵母菌等生产-内酰胺类抗生素中间体和半合成-内酰胺类抗生素改变天然青霉素的侧链结构，使其具有抵御抗药性微生物-内酰胺酶攻击的能力(2)溶栓酶用于急性心肌梗死、脑血栓、静脉血栓塞等治疗,三、微生物酶的种类,9、医药与分析研究用酶(3)超氧化物歧化酶(SOD)由两个亚基组成的金属酶。Cu-SOD、Zn-SOD、Mn-SOD和Fe-SOD等酵母菌、细菌及霉菌等治疗关节炎、
5、类风湿关节炎等；防晒、防衰老及抗炎等(4)透明质酸酶治疗关节损伤、关节周围炎症及膝外伤，传染性肝炎及肝硬化等用做药物扩散剂,四、产酶微生物的来源,1、土壤中的产酶微生物2、水体中的产酶微生物3、空气中的产酶微生物4、极端环境中的产酶微生物,1、土壤中的产酶微生物,土壤是微生物生活的大本营，为微生物生长繁殖及生命活动提供了各种条件工业中广泛应用的许多产酶微生物就来源于土壤。如枯草芽孢杆菌、假单胞菌、根霉、毛霉和青霉等,2、水体中的产酶微生物,水中溶解或悬浮的多种无机和有机物质，供给微生物营养，使其生长繁殖淡水：微球菌等海洋：古生菌(嗜盐菌)、细菌、真核类目前，已商品化的嗜盐酶类都是限制性内切核酸
6、酶,3、空气中的产酶微生物,空气中没有微生物生长繁殖所需要的营养物质和充足的水分，而且还有日光中有害的紫外线的照射，因此，空气不是微生物生长的良好场所，但空气中也漂浮着许多微生物工业生产中所用的产酶微生物不从空气中进行筛选,4、极端环境中的产酶微生物,极端环境下生长的极端微生物只能在很窄的温度、pH等范围下生存极端微生物有特殊的生理代谢类型，产生特殊的酶，这些酶在极端的条件下具有活性和高度的稳定性，具有很高的研究和应用价值由于极端微生物的培养条件要求很高，无法进行常规的工业发酵。需依靠在常温微生物菌体内相应的基因表达来实现,第一节结束,第一节结束,点击返回,第二节 微生物产酶的发酵工艺条件及控
7、制,一、产酶微生物的工业化要求及安全性二、微生物酶的发酵生产三、发酵的影响因素及其控制,一、产酶微生物的工业化要求及安全性,1、产酶微生物的工业化生产条件2、产酶微生物的安全性要求,1、产酶微生物的工业化生产条件,产酶量高，酶的性质符合要求，而且最好是分泌型的胞外酶，以便于酶的提取产酶菌不能是致病菌，在系统发育上与病原体无关，不产生毒素菌株稳定，不易变异退化，不易感染噬菌体能利用廉价原料，发酵周期短，易于培养，易于提取基因工程菌株必须符合安全性要求,2、产酶微生物的安全性要求,酶制剂生产时需通过安全检查医药和食品酶制剂需进行毒性试验尚未在法规机构GRAS(公认为安全的)的食品生产或加工的清单中
8、的微生物，需申请许可证,申请许可证须包括以下资料：酶及其来源微生物的描述酶制备方法 酶制剂的组成 酶或微生物的毒理数据,申请许可证须包括以下资料：酶及其来源微生物的描述酶制备方法：培养基的完全组成；生产设备；发酵条件(通气、搅拌、温度等)酶制剂的组成 单一酶、复合酶或是整个细胞 杂质如重金属、溶剂痕迹或来源于生产过程中的其他化学物质 用于分析组成和杂质浓度的分析方法的细节酶或微生物的毒理数据 微生物必须是非致病性的 微生物一定不能产生真菌素或其他毒性化合物 微生物一定不能产生抗生素,二、微生物酶的发酵生产,1、酶的发酵生产方法2、培养基的配制3、种子培养4、微生物发酵产酶的一般工艺,1、酶的发
9、酵生产方法,(1)固体培养法(2)液体培养法,1、酶的发酵生产方法,(1)固体培养法麸皮、米糠+其他成分 固体或半固体培养基 灭菌 发酵优点：设备简单；操作方便；酶浓度高；适于 霉菌培养缺点：劳动强度大；原料利用率低；生产周期 长；规模小,1、酶的发酵生产方法,(2)液体培养法将液体培养基置于发酵容器中，经灭菌、冷却后接入菌株进行发酵目前酶发酵生产的主要方式适于微生物，植物、动物细胞及工程菌的发酵优点：机械化强度高；易于管理控制；生产效率高、质量好；规模大,2、培养基的配制,配制原则营养丰富，浓度恰当各组分理化性质稳定，不互相反应黏度适中，有适当的渗透压所用原料利于目的产物的生物合成不影响通气
10、和搅拌，不影响产物的分离精制和底物处理原材料因地制宜、质优价廉、成本低,3、种子培养,又称种子制备，是指将处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量纯种的过程，它是发酵的第一道工序提供产量高、性能稳定、数量足且无杂菌污染的生产种子从培养基、培养条件、种龄和接种量等方面控制种子质量,4、微生物发酵产酶的一般工艺,三、发酵的影响因素及其控制,1、温度2、pH3、溶解氧4、基质浓度5、泡沫6、发酵终点判断,1、温度,影响酶催化反应速度和蛋白质性质；影响发酵液的物理性质(如黏度、基质和氧的溶解度和传递速率、基质的分解和吸收速率等)细菌发酵产酶的最
11、适温度往往低于最适生长温度控制：在不同发酵产酶阶段控制不同的温度条件控制方法：热水升温；冷水降温,2、pH,影响酶蛋白的解离度和电荷情况，改变酶的结构和功能，引起酶活性的改变影响细胞对基质的利用速度和细胞的结构，以至影响菌体的生长和产物的合成影响细胞膜的电荷状况，引起膜通透性发生改变，从而影响细胞对营养物质的吸收和代谢产物的形成控制：改变培养基的基础配方直接补加酸或碱添加生理酸性物质(NH4)2SO4和碱性物质(氨水)补料,3、溶解氧,临界氧浓度(C临)溶解氧浓度 C临时，造成浪费；抑制某些酶的生成；损伤细胞控制：供氧 提高氧分压；增加通气量；延长气液接触时间；增加气液比表面积；改变培养液的性
12、质；添加氧载体需氧 限制培养液中的营养成分，减少细胞生长速率；降低培养温度,4、基质浓度,培养基营养成分过低，影响菌体生长和酶的形成培养基过于丰富，菌体生长过盛，发酵液黏稠，传质差，不利于酶的合成，阻遏产物的形成控制：中间补料培养 补料分批培养(半连续培养)连续培养 补料内容：C源和能源；N源；微量元素或无机盐；酶的诱导底物,5、泡沫,减少发酵罐的装料系数减少氧传递系数控制：筛选不产流态泡沫的菌种调整培养基中的营养成分，或改变某些理化参数、发酵工艺来控制采用机械消沫或消泡剂,6、发酵终点判断,原则：高产量，低成本考虑因素最低的成本获得最大的生产能力产品质量不同发酵过程有不同的特点，个别进行分析
13、,第二节结束,第二节结束,点击返回,第三节 植物细胞培养产酶的特性、工艺条件 及控制,一、植物细胞培养产酶的特点二、植物细胞培养产酶的工艺条件三、培养的影响因素及其控制,一、植物细胞培养产酶的特点,优点(1)可以在人为控制条件下进行物质生产，克 服人工栽培的不足(2)提高产率(3)提高产品质量缺点(1)对剪切力敏感(2)发酵周期长,二、植物细胞培养产酶的工艺条件,1、植物细胞的培养方法2、培养基的配制3、植物细胞培养的一般工艺,1、植物细胞的培养方法,悬浮细胞培养 细胞株的建立 扩大培养 大罐培养 分批培养法 半连续培养法 连续培养法,2、培养基的配制,与微生物培养基有较大的差别(1)需大量的
14、无机盐。除了P、S、N、K、Na、Ca、Mg 等大量元素外，还需要Mn、Zn、Co、Mo、Cu、B、I等微量元素(2)需维生素和植物生长激素。如硫胺素、吡哆素、烟 酸、肌醇、生长素、分裂素等(3)氮源一般为无机氮源。即可以同化硝酸盐和铵盐(4)一般以蔗糖为碳源。蔗糖浓度一般为2%5%,3、植物细胞培养的一般工艺,三、培养的影响因素及其控制,1、温度2、pH3、溶解氧4、光照5、前体的添加6、诱导因子的应用,(控制在室温范围，2035),(微酸性，5.06.0),(通风或搅拌供给),4、光照,多数植物细胞生长以及次级代谢的生产需光照，并对光强度和光照时间有要求少数植物次级代谢的合成受光抑制控制根
15、据植物细胞的特性，及目的次级代谢物的种类不同，进行光照的调节控制,5、前体的添加,目的代谢物代谢途径上游的物质添加目的代谢物的前体，能提高植物细胞培养生产次级代谢物的产量 例：在培养辣椒细胞生产辣椒胺的过程中，添加苯丙氨酸作为前体，可以全部转变为辣椒胺。添加香草酸和异葵酸作前体，亦可显著提高辣椒胺的产量。,6、诱导因子的应用,目的代谢物代谢途径上游的物质添加诱导因子可提高次级代谢产物的产量，并促进产物分泌到培养基中 例：紫杉醇的细胞工程中，加入灭活的壳囊孢菌菌丝体和青霉菌的孢子，或硫酸钒等，可促进短叶红豆杉的悬浮细胞生长，并分泌更多的紫杉醇。,第三节结束,第三节结束,点击返回,第四节 动物细胞
16、培养产酶的特性、工艺条件 及控制,一、动物细胞培养产酶的特点二、动物细胞培养产酶的工艺条件三、培养的影响因素及其控制,一、动物细胞培养产酶的特点,主要用于生产：疫苗、激素、多肽生长因子、酶、单克隆抗体、非抗体免疫调节剂等功能蛋白质特点动物细胞没有细胞壁，细胞适应环境的能力差，十分脆弱体积比微生物细胞大几千倍，稍小于植物细胞的体积细胞生长缓慢，易受微生物污染，培养时需要抗生素培养过程需氧量少，且不耐受强力通风和搅拌细胞具有群体效应、锚地依赖性、接触抑制性及功能全能性营养要求复杂，须供给各种氨基酸、维生素、激素和生长因子等原代细胞继代培养50代后，即会退化死亡，需要重新分离细胞,二、动物细胞培养产
17、酶的工艺条件,1、动物细胞的培养方法2、培养基的配制3、动物细胞培养的一般工艺,1、动物细胞的培养方法,悬浮培养(血液、淋巴组织、肿瘤细胞、杂交瘤细胞等)贴壁培养(淋巴组织以外的组织、器官中的细胞，具锚 地依赖性)滚瓶培养系统；微载体系统 固定化细胞培养,2、培养基的配制,动物细胞培养基的组分复杂，包括氨基酸、维生素、无机盐、葡萄糖、激素、生长因子等 天然培养基(血浆凝块、血清、淋巴液、胚胎浸液以及羊水、腹水等)成分复杂，组分不稳定，来源有限，不适于大量培养和生产的需要 合成培养基(合成培养基+动物血清)成分明确，组分稳定，可大量生产供应 所用血清来源批次不同，重复性差；混有异种蛋白，分离困难 无血清培养基(基本合成培养基；基本合成培养基+生长因子；基本 合成培养基+组织抽提液)重复性好；避免血清的影响；供应充足、稳定；产品易于纯化,3、动物细胞培养的一般工艺,三、培养的影响因素及其控制,1、温度2、pH3、溶解氧4、渗透压 培养液中渗透压应与细胞内的渗透压处于等渗状态，一般在700850 KPa范围,(36.50.25),(微碱性，7.07.6),(调节进入反应器的混合气体的量及比例来调节溶解氧),第四节结束,思考题,为什么酶制剂的生产主要以微生物为材料？产酶微生物的工业化生产条件微生物发酵产酶的一般工艺发酵产酶的影响因素,第四节结束,点击返回,
