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1、第十一章 抗生素类药物的分析,一、概述,1.抗生素（antibiotics）：在低微浓度下即可对某些生物（病原微生物）的生命活动有特异抑制作用的化学物质的总称,2.分类,内酰胺类氨基糖苷类四环素类大环内酯类多烯大环类多肽类,3.来源：生物合成（发酵）化学合成或半合成4.抗生素的特点：化学纯度较低 活性组分易发生变异 稳定性差,生产工艺复杂发酵过程不易控制易受污染,5.抗生素质量分析采用生物学法与物理化学法鉴别：理化方法、微生物法检查：水分、pH值、异常毒性、热原、细菌内毒素、降压物质等含量/效价测定：微生物法：与临床疗效吻合,灵敏度高；但操作复杂费时 理化方法：准确度与专属性较高,且操作简便；
2、但与临床疗效有偏差,二、内酰胺类,包括青霉素类和头孢菌素类1.化学结构：,青霉素类：6-APA为母核头孢菌素类：7-ACA为母核,2.主要理化性质：1）酸性（羧基）：pKa 2.5-2.8 酸性较强 与碱金属成盐后水溶性好2）UV（共轭）：青霉素类：苯环取代基 头孢菌素类：母核有共轭结构,3）旋光性：有多个手性碳4）稳定性（内酰胺）：干燥条件较稳定，溶液不稳定 青霉素 降解、失效,3.鉴别1）羟肟酸铁反应：内酰胺类 羟肟酸 显色2）茚三酮反应-氨基 蓝紫色3）双缩脲反应内酰胺类 紫色4）光谱法（UV、NMR）5）色谱法（HPLC、TLC）,呈色反应,头孢利定的NMR鉴别法(JP14),取本品5
3、0mg溶于0.5ml重水中，测定NMR光谱时，应显示3.8 附近 6.97.5 7.99.0 单峰信号 多重峰信号 多重峰信号 2：3：5,强度比,头孢氨苄鉴别的TLC条件,ChP(2000)5mg/ml 2l 硅胶G 0.1mol/L枸橼酸液-0.2mol/LNa2HPO4-丙酮(120:80:3)；0.1%茚三酮溶液显色USP(24)25mg/ml 5l 硅胶 醋酸乙酯-水-乙腈-冰HAc(48:18:14:14)；短波长UV光检出BP(1999)0.4%(W/V)1l 硅烷化硅胶HF254 15.4%NH4Ac(pH6.2)-丙酮(85:15)；254nm检出,4.特殊杂质检查聚合物、有
4、关物质、异构体等,头孢他啶中聚合物测定色谱条件与系统适用性试验 用葡聚糖凝胶G-10（40120m）为填充剂，玻璃柱内径1.31.5cm，床体积5060ml；流动相A为含3.5%硫酸铵的0.01mol/L磷酸盐缓冲液（取磷酸氢二钠2.19g和磷酸二氢钠0.54g，加水1000ml使溶解，调节pH至7.0），流动相B为0.01%十二烷基硫酸钠溶液；流速为每分钟1ml；检测波长为254nm。以流动相A为流动相，用1mg/ml蓝色葡聚糖2000溶液进样200l进行测定，理论板数应不低于900，拖尾因子在0.751.5，对照品溶液以流动相B为流动相，重复进样200l，峰面积值的相对标准差应小于5.0%
5、,对照品溶液的制备：取头孢他啶对照品适量，精密称定，加水制成每1ml中含头孢他啶100g的溶液，摇匀,测定法 取本品适量，精密称定，加水制成每1ml中约含头孢他啶20mg的溶液，立即进样200l，以流动相A为流动相进行测定，记录色谱图；另取对照品溶液200l注入液相色谱仪，以流动相B为流动相，记录色谱图，按外标法计算，本品含头孢他啶聚合物以头孢他啶计不得过0.3%,头孢呋辛酯中有关物质和异构体的检查,色谱条件与系统适用性试验：测定头孢呋辛酯的HPLC系统为ODS分析柱；0.2mol/L磷酸二氢铵-甲醇（62:38）为流动相，流速1ml/min；检测波长278 nm。要求头孢呋辛酯A，B异构体之
6、间，头孢呋辛酯A异构体与头孢呋辛酯2-异构体之间的分离度应大于1.5；理论板数按头孢呋辛酯A异构体峰计算，应不低于1500,异构体,取本品适量，配制成每1ml中约含0.25mg的甲醇-流动相(11)的溶液，取20l注入液相色谱仪，记录色谱图。B异构体峰的相对保留时间约为0.85，A异构体峰的相对保留时间为1.0。供试品色谱图中A异构体峰的面积与A、B异构体峰的面积和之比应为0.480.55。,有关物质,取本品适量，精密称定，加流动相制成每1ml中约含0.2mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取适量，加流动相制成每1ml中约含6g的溶液，作为对照溶液。取对照溶液20l注入液相色谱仪，调节仪器灵敏度
7、，使主成分峰高约为记录仪满量程的10%，再取供试品溶液和对照品溶液各20l，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主峰保留时间的2.5倍，供试品溶液如显杂质峰，量取各杂质峰面积的和，不得大于对照溶液主峰的面积,5.含量测定1）碘量法（ChP2000）原理：青霉素与头孢菌素本身不与碘反应，但其碱性降解产物可消耗碘,青霉素族头孢菌素族,NaOH水解,4I2H+,8I-,I2+2Na2S2O3 2NaI+Na2S4O6,定量过量,剩余,反应分两步进行：水解反应(按化学计算量进行)氧化-还原反应(无定量关系，受温度、pH值和时间等因素影响，应严格控制反应条件并采用标准品平行对照测定),空白试验因样品中杂质会
8、消耗碘，故应作空白试验,空白试验与经典空白试验不同：加入样品，不加碱，其余试剂（醋酸盐缓冲液，碘液，硫代硫酸钠）都加,试验条件：（I2氧化）弱酸性（pH4.5）碱 I2 IO3-+I-酸 某些药物与碘生成复盐沉淀,温度（2426）温度38 时未水解的供试品亦消耗碘反应时间：（20分钟）20分钟后，耗碘量随时间的变化较小,特点灵敏度高：样品:碘=1:8反应条件、实验操作要求高含量,1份含量,V对、V对空V样、V样空,加试剂次序、反应时间、滴定速度相同,含量 对照品,V样空-V样 W对 V对空-V对 W样,2）电位配位滴定法（汞量法）原理：青霉素不与汞盐反应，其碱性降解产物可与Hg2+络和 Hg+
9、2R-SH(RS)2Hg+2H+,方法说明：a 空白试验与碘量法类似，加样品，不加NaOH b 与碘量法相比，汞量法不需对照试验,3）酸碱滴定法4）硫醇汞盐法 青霉素 青霉烯酸硫醇汞盐5）羟肟酸比色法 内酰胺类 红色6）HPLC法：应用广泛,咪唑HgCl2,（max 324345nm）,NH2OH,H+Fe3+,阿莫西林克拉维酸钾片,色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钠7.8g，加水900 ml溶解，用磷酸或10mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至4.40.1，加水稀释至1000ml)-甲醇(95:5)为流动相；流速为0.7ml/min；检测波长
10、为220nm。阿莫西林峰与克拉维酸峰的分离度应大于3.5,测定法 取本品10片，置1000ml量瓶中，加水适量，振摇使溶解，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取10ml，置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液10l注入液相色谱仪，记录色谱图；另取阿莫西林对照品与克拉维酸对照品各适量，加水溶解，制成每1ml中含阿莫西林0.5mg和克拉维酸0.25mg的混合溶液，同法测定。按外标法以峰面积分别计算供试品中C16H19N3O5S和C8H9NO5的含量。,三、氨基糖苷类,1.化学结构,链霉素,都是以氨基环醇与氨基糖缩合而成的苷 分子结构中都含有多羟基 均为碱性抗生素,2.性质1）碱性（氨基）
11、：临床应用其硫酸盐2）溶解度（氨基、羟基）：水溶性3）旋光性（糖）：多个手性碳4）稳定性（苷）：强酸、碱条件均可水解,3.鉴别1）茚三酮反应：具羟基胺类,-氨基酸性质 链霉素+水和茚三酮 蓝紫色2）N-甲基葡萄糖胺（Elson-Morgan）反应：链霉素 N-甲基葡萄糖胺 红色,水解,对二甲氨基苯甲醛,乙酰丙酮OH-,3）麦芽酚（Maltol)反应(链霉糖特有）链霉素 麦芽酚 紫红色,4.检查1）链霉素中链霉素B的检查 来源：发酵中产生 BP：薄层色谱法（杂质对照品法）,2）庆大霉素C 组分测定（系统适用性试验）色谱柱：ODS 流动相：H2O-HAc-MeOH配制的庚烷磺酸钠溶液(0.2M)，
12、必要时调节甲醇的含量 检测波长：330nm（邻苯二甲醛柱前衍生）要求：NC2 2000，C2a峰和C2峰的分离度应符合要求，重复进样RSD2.0%5.含量 微生物法、HPLC法等,四、四环素类,1.化学结构,2.性质1）两性：-OH：酸性 N(CH3)2：碱性 与酸、碱均可成盐；临床多用盐酸盐2）旋光性3）UV和荧光：4）与金属离子络合：酚羟基、烯醇基与Ca2+、Mg2+络合显色,5）稳定性 易发生异构化,降解等反应,性质不稳定,弱酸性（pH2-6）A环C-4异构化 差向四环素酸性（pH 2）C环脱水 脱水四环素 碱性 C环开环，形成内酯 异四环素,3.鉴别1）浓硫酸反应2）FeCl3反应：（酚羟基）显红色褐色3）TLC、HPLC4）荧光：（含共轭双键）紫外灯照射下产生不同颜色荧光,4.检查 TLC、HPLC法 杂质吸收度（降解产物颜色较深）5.含量 ChP、USP：HPLC法 JP：比色法,五、高分子杂质的检查,内源性：药物自身聚合物 来源于生产过程、贮存过程、使用不当外源性：蛋白、多肽、多糖及其与药物的结合物 来源于发酵过程,高分子杂质,高分子杂质控制方法,凝胶色谱法：葡聚糖凝胶 Sephadex G-10,
