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1、第十六章 药品质量控制中的现代分析方法与技术,Modern analytical methods&techniques in quality control of drugs,现代分析方法与技术为药学的发展提供了适时而有效的辅佐与动力。,如：色谱及其联用技术实现了药学的现代分子水平的研究。手性毛细管电泳及色谱分离与测定技术为手性药物研究与质量控制提供了保障。现代光谱技术使药物结构分析鉴定也变得寻常容易，药物的微量杂质检定与控制系统全面。,Capillary electrophoresis,CE,第一节、药物现代色谱法及其应用Modern chromatography&its applicati
2、on in pharmaceutical analysis,Near infrared spectrometry,NIRS,Nuclear magnetic resonance spectrometry,NMRSX-ray diffraction method,第二节、现代光谱法及其应用Modern spectrometry&its application in pharmaceutical analysis,HTC(Hyphenated Techniques in Chromatography),MS(Mass Spectrometry),GC-MS,HPLC-MS,HPLC-NMR,FTI
3、R(Fourier Transform Infrared),毛细管电泳分析法,毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）是80年代初发展起来的一种高效、快速的分离分析技术。在药物分析中有着重要的应用与发展前景自20世纪90年代初Menz等提出“微型全化学分析系统”（miniaturized total chemical analysis system，-TAS）概念以来，分析技术的微型化、集成化和自动化一直是分析科学发展的主导趋势，其中芯片毛细管电泳技术的研究已取得突出进展，在生物、临床、医药、工业和环境等领域中得到广泛应用。与传统毛细管电泳技术相比，芯片毛细管电泳
4、具有样品用量更少，分离速度更快的特点，但对检测的灵敏度和响应速度提出了更高要求,1.高效 2.高速 3.微量 4.低消耗,HPCE是经典电泳技术和现代微柱分离相结合的产物。与HPLC相比，均为液相分离技术，都有多种分离模式，且仪器操作可自动化；但遵循不同的分离机理。在很大程度上，HPCE和HPLC互为补充。HPCE更具有如下优点：,但HPCE的检出灵敏度和精密度不及 HPLC,毛细管电泳装置示意图,1.高压电源 2.光电倍增管 3.液冷温控毛细管 4.光源 5.数据采集 6.缓冲液/样品 7.缓冲液,30kV,7,1,2,3,4,5,6,a.毛细管中电渗流呈“塞式流”流型,b.HPLC柱中压力
5、驱动呈抛物线流型,Electroosmotic Flow,EOF,Electrophoresic Flow,EPF,毛细管电泳装置示意图,1.高压电源 2.光电倍增管 3.液冷温控毛细管 4.光源 5.数据采集 6.缓冲液/样品 7.缓冲液,30kV,7,1,2,3,4,5,6,应用示例,电泳条件石英毛细管（未涂层）57cm50m，优化选择25mmol/L磷酸二氢钠-12.5mmol/L硼砂-25mmol/L SDS（pH7.8）为电泳介质，操作电压20kV，柱温23，测定波长205nm 本文建立的优选方法可在11min内测定利巴韦林及中间体含量，与HPLC测定需1h相比，更快速。本方法也可用
6、于利巴韦林制剂中中间体的控制,利巴韦林及各中间体的定量分析,复方甘草片中甘草酸、甘草次酸、吗啡和 苯甲酸钠的分析21,复方甘草片为常用镇咳祛痰药，临床上有广泛的应用。每片含甘草浸膏（中粉）112.5mg、阿片粉4.0mg、樟脑2.0mg、八角茴香油2.0mg、苯甲酸钠（中粉）2.0mg 电泳条件石英毛细管65cm75m i.d.，有效长度50cm，运行缓冲液为50mmol/L硼砂溶液；运行电压14.0kV，电流70A；测定波长228nm；重力进样10s（高度7cm）定量分析经分析方法验证，本法具有良好的线性关系，回收率大于97.0%。该法可作为快速、准确测定复方甘草片中多组分含量的有效方法,药
7、物现代光谱法及其应用,近红外分光光度法,优点：无边缘干扰，线性范围(AC)宽水份吸收不覆盖C-H、N-H、O-H吸收带适用于水溶液样品，含水固体和泥浆状样不经溶剂稀释，不必制备KBr片，可直接测定，定量效果优于GC、HPLC和FTIR,峰强度 1/1001/10基频峰强度,方法特点,可获得一系列物理性质的信息由NIRS可得到如密度、粒子尺寸、纤维直径、大分子聚合度等特殊信息 样品无需预处理NIRS法仅需将样品装入样品池内而不必作预处理。一般，液体样品可以直接装入光路长130mm的石英池中。固体样品可直接放入具有石英窗的反射样品杯中；盖上弹簧压缩盖，即可。在1 min内即可完成装样；取出样品、清
8、洗杯子的时间也不需1min,NIR反射谱又与MIR不同，它有以下特点：,分析速度快通常，将样品杯置入NIR 光谱仪内，每秒进行5次扫描；一般扫 描50次求得平均值制得最后的光谱，继 之将光谱数据进行加工以作数据的定量 或定性的解释。通常，作一次NIRS分 析仅需2 3 min,灵敏度高NIRS光源强度较大，检测器的反应灵敏度较高，因而检测信噪比高，尤其在散射效应强时，散射-吸收比高,运用范围广在反射和散射NIR中，高的信噪比可以得到良好的线性关系，对分析样品的外观宽容度大，既可以用于清澈的气、液、固样品的测定，又可用于粉末状、糊状、丝状和不规则状样品的分析,便于在线分析和控制NIR区内还有价格
9、便宜耐用的透明材料（一般的光学玻璃）作为分析窗口，便于实现快速、实时，并有池长对分析结果影响小，定量分析的范围宽等优点,应用示例 诺氟沙星胶囊的NIRS分析,UV、HPLC测定含量，均需对样品进行预处理，较繁琐费时。采用近红外漫反射光谱（near-infared diffuse reflectance spectrometry，NIRDRS）技术及偏最小二乘法（PLS）对诺氟沙星胶囊进行含量测定的回收率好，与其他方法相比，还具有分析简便、快速的优点,核磁共振光谱分析法,核磁共振光谱(nuclear magnetic resonance spectrometry，NMRS)技术已在BP和USP中
10、应用，在新药的研制中，如药物结构确证，药物代谢物的研究和药物的筛选和设计等方面，更是重要的分析方法之一。重点讨论定量分析方法及应用示例,简述,NMR(nuclear magnetic resonance),肌肉松弛剂,定性、定量和杂质检查,不同药物具有不同NMR图谱,样品中每个组分有一个或一组特征的、且互不重叠的吸收峰,Maolate 异构体,Maolate 异构体,内标法（绝对测量法）,NMR最常用的定量分析方法内标物的要求：最好能产生单一的共振峰，与样品间隔30Hz能溶于分析溶剂中有尽可能小的质子当量不应与样品中任何组分相互作用,亚硝酸戊酯(Amyl nitrite)及其吸入剂(Amyl
11、nitrite inhalant)的NMR定量分析 USP,分子中与亚硝基相邻的次甲基上的质子呈现多重峰 4.8ppm内标：苯甲酸苄酯 C6H5COOCH2C6H5 呈现单一峰=5.3ppm以TMS为对照=0.ppm,3-甲基-1-丁醇亚硝酸酯,2-甲基-1-丁醇亚硝酸酯,应用示例,盐酸普鲁卡因的结构鉴定植物中药及其伪品的区别,伪品中药在外观特征上几可以假乱真，但其化学成分的组成，尤其是活性成分却不可能与正品完全一致，并且相差甚远。以正品植物中药的1H-NMR相对标准图谱为参照，只需比较所鉴别样品的1H-NMR谱就可以断定中药的真伪。以人参为例说明之,试验测定了伪品人参，其1H-NMR指纹图均
12、与正品的特征峰毫无相似之处,亚硝酸戊酯（amyl nitrite）及其吸入剂（amyl nitrite inhalant）的含量测定（USP 24）,X射线粉末衍射法,X射线是伦琴在1895年发现的，又曾称为伦琴射线。本质上是波长很短的电磁波，一般认为波长为0.011nm，较紫外线还短。作为波，就可以产生衍射。所谓衍射，就是绕过障碍物边缘向前传播的现象当X射线射到晶格排列整齐的晶体上，仅仅在某些方向有光线反射，这就是 X射线的衍射。有光线反射的方向可用布拉格方程加以描述,X射线衍射法的理论依据,式中为掠射角；dhkl为 晶面间距；hkl为晶面指数，即晶面与晶轴截距的倒数之比，也叫密勒指数,布拉
13、格方程,布拉格方程给出了什么条件下衍射的X射线可能从晶体射出已知晶面间距(d)和入射线波长()，即可求出衍射线方向()，也可给出进行X射线衍射的晶体的晶面间距已知入射线波长()和衍射线方向()，即可求出晶面间距(d)。当然晶面有若干组，都可产生相应衍射，这些衍射均可由X射线衍射仪进行测定,X射线衍射仪的工作原理,X射线管中不同靶材料，如铜、石墨等可发出各自 特征波长 晶体粉末尽可能紧密地装入玻璃毛细管，压成多晶圆柱体。当穿过铅块狭缝的一细束X射线射到晶体粉末时，总会有取向合适的微小晶体，使射线在其表面反射最强,X射线衍射仪的工作原理一般采用粉末法。粉末衍射仪的构成与工作原理见下图,由反射方向，
14、根据布拉格方程即可求出晶面间距，进而求出键长。本法可同时将各种波长的X射线反射到不同方向，记录为衍射图谱,在新药研制过程中，必需对药物结构进行确证，固体样品一般要做X射线粉末衍射分析，以便从测定结果可比较研制品与对照品是否一致。X射线粉末衍射法是药物晶型进行定性鉴别的重要方法之一,应用,应用示例西咪替丁的晶型研究 尹华等 药物分析杂志 2001，21(1)：3942,测试条件：Cu k（靶），50kV-80mA（工作电压-电流），8()/min，DS=SS=1，RS=0.15mm(狭缝)，2 A晶型和B晶型的X射线测定数据见表 X射线衍射法除了用于晶型鉴别外，也可用于晶型药物的定量分析,A晶型
15、和B晶型的X射线测定数据,A晶型B晶型,衍射角晶面距丰度比衍射角晶面距 丰度比,X射线晶体结构分析,若以已知波长的X射线入射，也会对不同的平面族获得最强的反射，据此可以测定晶格常量，进而确定晶格构造。这就是 X射线晶体结构分析重要意义确定药物结构及生物大分子结构原理如此，具体做起来还是一件十分复杂的工作，特别是对新化合物结构的确定，常要借助于电子计算机，例如四圆衍射仪，可以直接测量化合物的键长键角等数据,色谱联用技术及其应用,GC-FTIR系统组成,着重围绕几种应用较广泛的色谱联用技术及其在药物分析中的应用予以简述,气相色谱-红外光谱联用技术,GC/FI-IR联用光路示意图,抛物面镜,干涉仪,
16、光源,接口,椭面鏡,光管,FID或放空,GC柱出口,GC,FT-IR,IR,抛物面镜,麝香风湿油GC分析图谱 1.-蒎烯 2.-蒎烯 3.桉树脑 4.樟脑 5.水杨酸甲酯 6.桂皮醛 7.茴香酸甲酯 8.丁香酚 9.2-甲基十一烯 10.邻苯二甲酸二丁酯 11.正十六烷,11,t(min),1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,气相色谱-质谱联用技术,GC-MS仪的接口组件是解决气相色谱和质 谱联用的关键组件，它起传输试样，匹配两者工作流量（也就是工作气压）的作用。理想的接口应能去除全部载气而使试样毫无损失地从气相色谱仪传输给质谱仪。要求试样传输产率高，浓缩系数大，延时短，色谱的峰展宽少,
17、GC-MS工作原理示意图,载气,样品,进样器,色谱柱,分子分离器,抽真空,记录仪,放大器,离子源,分析器,电子倍增管,放大器,示波器,质谱,应用示例,在药物中毒急救、预防和刑事侦破工作中常需要在生物体液中进行未知毒物的鉴定。由于未知毒物的范围非常广泛，理化性质各异，因此，有必要建立一系统化的尽可能多的毒物药物的分析方法,固相萃取结合GC-MS系统分离生物体液中常见毒物药物,GC-MS测定冰片和川芎嗪血药浓度,GC-MSD的选择性离子检测色谱图A.标准样品 B.血浆样品1.川芎嗪 2.樟脑 3.4.龙脑,质谱图,液相色谱-质谱联用技术,粒子束（partical beam）接口 不适用于极性的、热
18、不稳定的和分子量大于1000的样品分子 热喷雾（TSP）接口TSP接口的应用正逐步减少,以下重点阐述LC-MS的关键部件、接口装置和应用,接口装置,USP（24）中列出了如下几种接口装置,大气压离子化（API）接口 是目前商品 化LC-MS仪采用最广的接口,动态快原子轰击法（FAB）FAB法适合于高活性、低蒸汽压、热稳定性低及分子量大的样品分析，而且样品用量少。该接口的缺点是限制HPLC的流速，通常为10l/min，只能使用微型柱,应用示例,曲安奈德中特殊杂质的检查,曲安缩松(TACA)Triamcinolone Acetonide,杂质峰,3.85,350,600,550,500,450,曲
19、安缩松及其杂质的质谱TACA:曲安缩松；desmethylene TACA:去甲曲安缩松,400,50,100,150,200,250,300,100.0,100.0,50.0,50.0,293,59,75,85,93,115,135,147,159,173,187,199,213,225,237,269,253,281,590,569,549,535,519,507,493,475,463,455,443,435,421+,339,347,359,415,387,377,367,293888,293888,TACAMH+,-HF,TACA,(M+C2H5)+,(M+C2H5)+,Desmet
20、hylene,TACA MH+,421+,去甲曲安缩松 Desmethylene TACA,曲安缩松(TACA)Triamcinolone Acetonide,液相色谱-核磁共振联用技术,LC-MS已成为复杂体系中各化合物结构分析的重要方法，而MS无法完全解决位置异构、立体异构等化学结构问题,氯苄律定抗心律失常药86017代谢的初步研究,中文名 7-(4-氯苄基)-7,8,13,13a-四氢小檗碱氯化物英文名 7-(4-Chlorbenzyl)-7,8,13,13a-tetrahydroberberine chloride;CTHB,86017 保持了母体化合物的生物活性：母体具有正性肌力，降
21、低动脉血压，增加冠脉流量及抗心律失常作用，但口服不吸收，生物利用度差,对心律失常及心室纤颤有较强的防治作用，对急性心肌梗塞亦有较好疗效，而且口服能吸收,Berberine(B)Tetrahydroberberine(THB),C18柱 2504.6mm,10m色谱条件：甲醇:水:三乙胺:冰HAc(60:40:0.04:0.03)287nm;1ml/min,a 空白尿样提取物,空白鼠胆汁提取物(CHCl3)代谢样品,0 25 50min,LC/NMR：证哪一个-OCH3被脱甲基化,CTHB的结构和提出的代谢途径,CTHB在大鼠体内的代谢途径,创新意识,不断探索,勇于实践,+,+,祝各位学业有成！,新年快乐心想事成！,祝各位,谢谢大家！,
