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1、1,化学发光分析法,现代表征方法与技术-,Chemiluminescence analysis,2,一、基本原理principle 二、化学发光分析的特点characteristics三 装置与技术instrument and technology,化学发光分析法,3,一、基本原理 principle,1.化学发光反应 在化学反应过程中，某些化合物接受能量而被激发，从激发态返回基态时，发射出一定波长的光。A+B=C+D*D*D+h（1）能够发光的化合物大多为有机化合物，芳香族化合物；（2）化学发光反应多为氧化还原反应，激发能与反应能相当 E=170300 kJ/mol；位于可见光区；（3）发光
2、持续时间较长，反应持续进行；化学发光反应存在于生物体(萤火虫、海洋发光生物)中，称生物发光(bioluminescence)。,4,2.化学发光效率,化学效率：,发光效率：,时刻t 的化学发光强度(单位时间发射的光量子数)：,dc/dt 分析物参加反应的速率；,5,3.化学发光强度与化学发光分析的依据,在化学发光分析中，被分析物相对于发光试剂小得多，对于一级动力学反应：,dc/dt=Kc；K 为反应速率常数。定性依据：（1）在一定条件下，峰值光强度与被测物浓度成线性；,（2）在一定条件下，曲线下面积为发光总强度(S)，其与被测物浓度成线性：,6,4.化学发光反应的类型,（1）气相化学发光反应a
3、.一氧化氮与O3的发光反应 NO+O3 NO2*NO2*NO2+h 发射的光谱范围：600875nm，灵敏度1ng/cm-3；b.氧原子与SO2、NO、CO的发光反应 O3 O2+O（1000 C石英管中进行）SO2+O+O SO2*+O2 SO2*SO2*+h 最大发射波长：200nm；灵敏度1ng/cm-3；,7,O3 O2+O（1000 C石英管中进行）NO+O NO2*NO2*NO2+h 发射光谱范围：4001400nm；灵敏度1ng/cm-3；氧原子与CO的发光反应：CO+O CO2*CO2*CO2+h 发射光谱范围：300500nm；灵敏度1ng/cm-3；,氧原子与NO的发光反应
4、：,8,c.乙烯与O3的发光反应,乙烯与O3反应，生成激发态乙醛：,CH2O*CH2O+h 最大发射波长：435nm；对O3的特效反应；线性响应范围1 ng/cm-3 1g/cm-3；,9,（2）火焰中的化学发光反应,在富氢火焰中，也存在着很强的化学发光反应；a.一氧化氮 NO+H HNO*HNO*HNO+h 发射光谱范围：660770nm；最大发射波长：690nm；在富氢火焰中：NO2+2H NO+H2O 该反应十分迅速；,10,b.硫化物,挥发性硫化物SO2、H2S、CH3SH、CH3SCH3等在富氢火焰中燃烧，产生很强的化学发光（蓝色）：SO2+2H2 S+2H2O S+S 2S2*S2
5、*S2+h 发射光谱范围：350460nm；最大发射波长：394nm；灵敏度：0.2 ng/cm-3；发射光强度与硫化物浓度的平方成正比。,11,（3）液相中的化学发光反应,机理研究较多，在分析中应用最多；可测痕量的H2O2、Cu、Mn、Co、V、Fe、Cr、Ce、Hg、Th等。应用最多的发光试剂：鲁米诺（3-氨基苯二甲酰肼）；化学发光反应效率：0.150.05；鲁米诺在碱性溶液中与双氧水的反应过程：,该发光反应速度慢，某些金属离子可催化反应；利用这一现象可测定这些金属离子。,12,5.化学与生物发光分析的应用,（1）该发光反应速度慢，某些金属离子可催化反应；利用这一现象可间接测定这些金属离子
6、。可测痕量的Cu2+、Mn2+、Co2+、V4+、Fe2+、Fe3+、Ni2+、Ag+、Au3+、Hg2+等（2）可检测低至 10-9 mol/L 的H2O2；（3）间接测定某些生物试样,氨基酸+O2 酮酸+NH3+H2O2,氨基酸氧化酶,葡萄糖+O2+H2O 葡萄糖酸+H2O2 通过测定生成的H2O2，确定氨基酸、葡萄糖含量。,葡萄糖氧化酶,13,草酸二酯(能量提供体)+高浓度双氧水+稠环芳烃(能量接受体)+金属离子+溶剂组成的反应体系，可发出很强的可见光，发光效率高，使用不同的稠环芳烃，发射出不同颜色的光(冷光源)。,14,生物发光分析应用 1,在pH 78；荧光素酶(E)和Mg2+的存在
7、下，荧光素(LH2)与磷酸三腺甙(ATP)的反应，生成磷酸腺甙(AMP)荧光素和荧光素酸的复合物和镁的焦磷酸盐(ppi)：,ATP+LH2+E+Mg2+AMP LH2 E+Mg ppi+2H+,pH7-8,复合物与氧反应，产生化学发光：,AMP LH2 E+O2 氧化荧光素*+AMP+CO2+H2O氧化荧光素*氧化荧光素+h最大发射波长562nm；,15,生物发光分析应用 2,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)在细菌中的黄素酶作用下，在氧化型黄素单核苷酸(FMA)存在下，发生发光反应：,NADH+FMA+H+NAD+FMNH2,NADH脱氢酶,FMNH2+RCHO+O2 FMN+RCOOH+H2
8、O+h,黄素酶,最大发射波长495 nm；,16,二、特点 characteristics,1.灵敏度极高 例：荧光素酶和磷酸三腺甙(ATP)的化学发光分析，可测定210-17。Mol/L的ATP，即可检测出一个细菌中的ATP含量2.仪器设备简单 不需要光源、单色器和背景校正；3.发射光强度测量无干扰 无背景光、散射光等干扰；4.线性范围宽5.分析速度快缺点：可供发光用的试剂少；发光反应效率低（大大低于生物体中的发光）；机理研究少。,17,18,19,三、装置与技术 instrument and technology,装置流程：,发光反应可采用静态或流动注射的方式进行：静态方式：用注射器分别将试剂加入到反应器中混合，测最大光强度或总发光量；试样量小，重复性差；流动注射方式：用蠕动泵分别将试剂连续送入混合器，定时通过测量室，连续发光，测定光强度；试样量大；,
