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1、,第14章 多倍体与转基因动物,14.1 多倍体动物,动物多倍体比较少，原因：（1）高等动物远源杂交能力很弱，很难形成杂种个体；（2）多倍体动物高度不育，染色体异常通常会千万胚胎死亡，很难得到多倍体后代。但低等脊椎动物如鱼类、两栖类和爬行类。,多倍体动物,产生原理：染色体的加倍可以通过保留受精卵第二极体即抑制卵子的第二次成熟分裂或抑制受精卵的第一次卵裂来实现。,鱼类精子入卵的时期是第二次减数分裂的中期，刺激卵子继续完成第二次分裂。卵中原有的二组染色体中一组作为第二极体排出受精卵成为正常的二倍体。如果在精子入卵时第二极体不能正常排出，则精卵原核结合成为三倍体受精卵。如果卵子受精后，照常排出第二极
2、体形成单倍体卵，单倍的卵原核与单倍的精原核结合就形成二倍的受精卵，这时再抑制受精卵的第一次卵裂，则产生四倍体。,1 多倍体动物培育方法,A 物理方法,机制主要是通过破坏微管形成，使由微管蛋白聚合成的微管解体或阻止微管的聚合过程，使染色体失去移动的动力，人为抑制染色体向两极移动，形成多倍体细胞。,（1）温度休克法：即用略高于或略低于致死温度的冷或热休克来诱导三倍体(抑制第二极体排放)或四倍体(抑制第一次卵裂)的方法。根据处理温度的高低分为热休克法和冷休克法。一般冷水性鱼类如蛙科鱼类，宜用热休克，温度范围为28-36;温水性鱼类宜用冷休克，温度范围为0-5左右。,优缺点：简便、廉价，但诱导率较低。
3、,（2）水静压法：采用较高的水静压（如65kg/cm2）可抑制,卵母细胞第二极体的释放或者抑制第一次卵裂诱导产生多倍体的方法。,原理：静水压处理破坏了有丝分裂器中的纺锤丝即纺锤体和星体，从而暂时阻断了有丝分裂的进程。,该方法处理程序标准化易于掌握，处理时间短(3-5min)，诱导率较高，对受精卵损伤较小。但需专门的设备如水压机等。此外，静水压处理还使染色体发生了不同程度的凝缩，,还可能使受精卵的结构发生某些物理和化学变化，造成发育受阻，因此在生产中应用较少。,B 化学法,细胞松弛素诱导法：细胞松弛素B(CB)导致极体的保留是通过阻止卵子微丝环的收缩和极体的分离来实现的。CB处理比其他方法能更有
4、效地诱导三倍体的形成。,6-甲氨基嘌呤诱导法：6DMAP 是一种蛋白激素酶抑制剂。当6DMAP 与微管蛋白二聚体结合以后对微管正常的结构和功能起到了抗有丝分裂的作用，因此可以产生三倍体。,C 生物法：主要是远缘杂交法,瑞齐（Rasch）等于1965首先证明了三倍体脊椎动物可通过四倍体个体与二倍体个体杂交产生。,化学法缺点：成功率较低，且对胚胎及操作者有毒性，影响存活。,2 多倍体动物的鉴定,人工诱导处理过的群体可能是由多倍体、二倍体甚至是多倍体与二倍体构成的嵌合体等混合群体，所以需要筛选出需要的多倍体。,（2）核仁染色观察法：一般而言，细胞核仁数量与染色体组数目（倍性）成正比例，通过银染法检测
5、胚胎细胞核仁数量及分布情况可以鉴定多倍体，直观、可靠。,（1）染色体计数法：将细胞固定制片、染色后观察染色体个数。由于染色体制片技术比较成熟，因此该方法仍是目前鉴定多倍体倍性的一种直观、可靠的方法，缺点是比较费时。,（4）DNA含量测定：染色体组数与DNA含量成正比。测定单个细胞的DNA含量，根据细胞DNA比较来推断出细胞的倍性。如果发现杂种的DNA含量是其亲本的一倍半，就可以确定这些杂种是三倍体。DNA含量测定法快速准确，能测出嵌合体，但是缺点是需要专门仪器。,（3）核体积测量法：一般而言，细胞核大小与染色体数目成比例，为了维持恒定的核质比例，随着细胞核的增大，细胞大小也按比例增加。因此多倍
6、体细胞及细胞核通常要比二倍体大一些。一般通过测定红细胞核体积的大小可以鉴定染色体的倍性。缺点是比较费时、准确性不高。,14.2 转基因动物,1.转基因动物（transgenic animal）：是指在基因组内稳定地整合外源基因，并且外源基因可以稳定地遗传给后代的基因工程动物。,利用转基因动物生产人类药用蛋白、异体器官等非常规畜牧产品，是目前世界上转基因动物研究的热点之一。,2.转基因动物培育方法,（1）原核期胚胎显微注射法：几百KB大片段、应用广泛,目的DNA制备（无需构建载体）,DNA注入原核胚（受精卵雄核）胚胎体外培养,胚胎移植（移植前鉴定）发育,出生、鉴定,1980年，Gordon等人首
7、先育成转人生长素基因小鼠。世界第一个转基因动物。生长速度快24倍、体形,大一倍的转基因“硕鼠”。,发表在1982年的nature杂志上。,原核期胚胎显微注射法,原核期胚胎显微注射法改进为体外受精转基因法,（2）胚胎干细胞方法,胚胎干细胞（ES）是一种含正常二倍染色体的具有发育全能性的细胞，因此只要将外源DNA导入胚胎干细胞就可以实现基因的转移。,（3）精子载体法：精子与外源DNA混合培养，DNA可被吸收进入精子头部，然后再与卵细胞受精后发育成转基因动物。,（4）逆转录病毒感染法：见11.10。,（5）卵细胞显微注射法：将外源DNA克隆到逆转录病毒载体上，再显微注射到M II中期卵细胞（无核膜）
8、，再体外受精，胚胎移植，发育成转基因动物。,Chapter 14,细胞工程,Copyright 2011 Wang Weidong,All rights reserved.,反转录病毒感染法,Chapter 14,细胞工程,Copyright 2011 Wang Weidong,All rights reserved.,东北农业大学国内首例绿色荧光蛋白“转基因”克隆猪绿色荧光蛋白猪胎儿成纤维细胞克隆,Chapter 14,细胞工程,Copyright 2011 Wang Weidong,All rights reserved.,Genetically modified animalhttp:/
9、GloFish fluorescent fish,the first geneticallymodified animal to be sold as a pet,目的基因的鉴定：检查动物体内是否有外源基因的存在，以判明是否是转基因动物。可用聚合酶链反应(PCR)、斑点杂交(Dot blot),Southern印迹分析等多种方法进行检测。,目的蛋白的鉴定：有活性的目的蛋白的检测非常重要。检测方法主要有：(1)SDS聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE),(2)酶联免疫吸附实验(ELISA)(3)Western印迹分析,3 转基因动物鉴定,（1）快速生长与肉质改善。如转生长素基因的猪生长快，瘦肉率也
10、高。,（2）增加羊毛产量和性能。细菌基因SAT和DAS可以促进合成Cys，将该基因转入羊肠胃道上皮细胞，可提高羊毛产量。若将毛角蛋白II中间细丝基因转入绵羊基因组中，所产羊毛光泽亮丽、毛脂含量高暖和。,（3）抗冻动物品种培育。将鱼抗冻蛋白基因AFP转入不耐寒鱼或其他动物。,4 转基因改良动物的应用,5 转基因动物乳腺生物反应器（乳腺是最理想的药物蛋白生产场所）,（1）概念：将外源基因置于乳腺特异性调节序列之下，使之在乳腺中表达，然后通过回收乳汁获得重要价值的生物活性蛋白的技术。,1987 年Gordon 等将组织型纤溶酶原激活剂(tPA)与小鼠乳清酸蛋白(WAP)基因的启动子构成重组基因，成功
11、地培育出了37只在乳汁中能表达tPA 的转基因小鼠.,2006年6月2日，世界上第一个利用转基因动物乳腺生物反应器生产的基因工程蛋白药物重组人抗凝血酶（商品名：ATryn）上市获得批准。,目前，1-抗胰蛋白酶(AAT)、人乳球蛋白、凝血因子III、IV、VIII、纤维蛋白原、降钙素、SOD、红细胞生成素、IGF-1等成功表达，多种药用蛋白已经进入临床试验阶段。,上海交通大学医学遗传研究所：,（1）1998年中国首头转基因羊。乳汁中表达人凝血因子IX蛋白。人凝血因子IX是治疗血友病的药物。,（2）1999年，带有人血清白蛋白基因的转基因试管牛“滔滔”降生。,Chapter 14,细胞工程,Cop
12、yright 2011 Wang Weidong,All rights reserved.,1998年上海医学研究所与复旦大学遗传所合作获得在乳腺肿表达有生物活性的人凝血因子IX转基因山羊,（2）关键环节,使用合适的乳汁蛋白基因调控元件，构建合理有效的乳腺组织特异性表达载体。,目前应用于乳腺特异性表达载体构建的乳蛋白基因及调控序列的主要有：,乳清酸蛋白(WAP）基因及其调控序列。酪蛋白(Icasein)基因及其调控序列。,-乳球蛋白(-lactoglobulin)基因及其调控序列。,乳白蛋白(-lactalbumin)基因及其调控序列。,（3）存在问题,（1）理论基础薄弱和技术不完善，致使转基因在受体动物基因组随机整合，遗传不稳定、表达率不高。,（2）异位表达和表达产物的泄漏问题，需要乳腺组织特异性高效表达载体，保证外源基因在乳腺中专一表达。,（3）在家畜转基因技术方面，目前多用原核胚胎显微注射，平均成功率比较低，需要大量的供体和受体动物。,
