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1、第六章 核酸的分离与纯化,王文君,广州中医药大学分子生物学技术实验室免疫研究室,一、概述,核酸分离提取的原则常用方法及基本原理DNA的分离纯化RNA的分离纯化,第一节 核酸分离提取的原则,一、基本原则1.保证核酸一级结构的完整性。2.排除其它分子的污染。二、注意事项1.简化操作步骤，减少对核酸的破坏。2.避免过酸（碱）等化学因素的影响（pH410）。3.减少物理因素对核酸的降解。4.防止核酸的生物降解。,三.主要步骤：1.破碎细胞。2.去除与核酸结合的蛋白质，多糖以及脂类等生物大分子。3.去除其它不需要的核酸分子。4.沉淀核酸，去除盐类、有机溶剂等杂质。5.核酸纯化。核酸提取的方案，应根据具体
2、生物材料和待提取的核酸分子的特点而定。只有采取合适的核酸提取方法，才可获得完整性和纯度两方面质量均高的核酸分子。下面介绍核酸分离纯化的基本方法及不同来源DNA的分离提取方法。,第二节 分离制备核酸的常用方法及基本原理,一.溶解法：酚/氯仿抽提法的基本原理1.交替使用酚、氯仿这两种不同的蛋白质变性剂，以增加去除蛋白杂质的效果。2.氯仿与苯酚混合使用，对于RNA的提取显得更加重要，因酚可有效变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶的活性。而且酚能溶解1015%的水，从而溶解部分Poly（A)RNA。,3.氯仿能加速有机相与水相分离，去除植物色素和蔗糖。用氯仿抽提以去除迹量酚。4.用水饱和的乙醚抽提最后一
3、次，彻底去除迹量酚和氯仿。然后68水浴10分钟蒸发迹量乙醚。5.异戊醇可减少蛋白质变性操作过程中产生气泡。酚/氯仿抽提法标准程序是：酚抽提一次，酚/氯仿抽提一次，氯仿抽提一次。,蛋白杂质,有机相,水相（核酸溶液）,高速离心后的分层情况（酚/氯仿抽提法）,注意事项：1.一般酚是透明无色的结晶。酚结晶如呈现粉红色或黄色，表明其中含有酚的氧化产物如醌、二酸等。变色的酚溶液不能用于实验，因其中的酚氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键，并引起DNA链的交联。2.酚的水饱和：饱和酚的pH值接近8.0，可减少离心后水酚双向的交界面上的DNA滞留；由于在酸性pH值条件下，DNA分配于有机相，因此使用前必须对酚进行平衡
4、使其pH值在7.8以上。,制好的饱和酚贮于棕色瓶中4可保存1个月。因酚的氧化随pH值的增高而增加，如所用平衡缓冲液的pH值8及RNA的提取都应使用新鲜饱和的酚。,二、层析法利用物质在静止相和移动相之间分配系数的差异，进行物质的分离和纯化的技术称为层析。层析体系中一般由两个互相不溶的介质组成，静止相多为固体，移动相多为液体。羟磷灰石是一类特殊的层析材料，对核酸有较大的亲和力，并在大多数条件下不吸附蛋白质和多糖，所以能纯化核酸。双股DNA与羟磷灰石的结合较牢固，如将细胞的溶解液流经羟磷灰石柱，然后用低浓度磷酸缓冲液流洗，以去除RNA、蛋白质及其它物质。随即再用浓度高的磷酸缓冲液洗脱，即可获得DNA
5、。,三、电泳法凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为分离、鉴定和提纯核酸首选的标准方法。常用于核酸分离的凝胶电泳主要有琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。四、超速离心法根据核酸分子的物理特性如分子量、密度等的不同，可用密度梯度超速离心的方法加以分离纯化。,1.CsCl沉降平衡超速离心CsCl沉降平衡超速离心是纯化DNA分子的主要方法：可分离CC(双链闭合环状)、OC（开环双链）、L（线性）三种结构的DNA分子。质粒DNA的这三种结构分子与EB结合能力不同（LOCCC），EB插入DNA分子中可使其浮力密度下降，结合EB越多、浮力密度越小。可分离双链DNA分子的两条互补链。分离浮力密度不同的
6、DNA分子或其他分子颗粒，如图1。,图1 氯化铯梯度纯化噬菌体噬菌体在1.45g/ml与1.50g/ml氯化铯界面之间形成一肉眼可见的带。在1.45g/ml与1.50g/ml氯化铯界面之间可看到一个由噬菌体颗粒形成的浅蓝色带。,纯化DNA分子。在中性CsCl溶液中，DNA的浮力密度为1.7g/ml，RNA为2.0g/ml，蛋白质的浮力密度为1.31.4g/ml。在起始密度为1.7g/ml的CsCl溶液中进行超速离心，可以很好地将三者区分开。蛋白质浮在上层液面，DNA分子在离心管中间形成区带，RNA沉于管底，从而达到从DNA样品中去除微量RNA和蛋白质的目的。2.蔗糖密度梯度超速离心可用于分离不
7、同大小的DNA片段,五.核酸的沉淀浓缩法原理：核酸与Na、K、Mg等形成的盐在许多种有机溶剂中不溶解，但也不会被有机溶剂变性。（一）核酸沉淀的盐类及浓度1.NaAc：最常用，终浓度为0.3M（pH5.0）2.NaCl：终浓度为0.2M，除去SDS。3.NH4Ac:去除dNTP，铵盐抑制磷酸化等反应。4.LiCl：高浓度（0.8M）可直接沉淀大分子量RNA。抑制反转录酶反应和翻译（蛋白合成）实验。5.KAc：与NaAc相似，钾盐形式难溶于含SDS的溶液。6.MgCl2：对于浓度低于0.1g/ml或长度小于100个核苷酸的样品，可提高核酸沉淀的回收率。,样品溶液中含盐浓度过高，应用TE进行稀释。（
8、二）核酸的有机沉淀剂1.乙醇：沉淀DNA的首选有机溶剂。DNA沉淀用2倍体积，RNA沉淀用2.53倍体积。2.异丙醇：所需体积小速度快。0.541倍体积。常规需用70%乙醇漂洗沉淀数次。3.聚乙二醇（PEG）：可用不同浓度的PEG选择沉淀不同分子量的DNA片段。PEG 6000，其使用浓度与DNA片段的大小成反比。70%乙醇漂洗沉淀2次。4.精胺：精胺与DNA结合后，使其结构凝缩而发生沉淀。要求低盐或无盐。常规需用70%乙醇漂洗沉淀数次。,（三）核酸沉淀的条件在一般条件下的DNA沉淀，使用0冰水，1015min足可达到实验的要求。RNA的沉淀一般采用等体积异丙醇，置-20，30min。若RNA
9、的浓度过低，可置20沉淀过夜。低温与过长时间的沉淀，易导致盐与核酸共沉淀，影响以后的实验，需加注意。大多数的DNA沉淀在04，12000g离心10min即可。如果DNA片段小于100个核苷酸，则需超速离心：如Beckman SW28，4，27000r/min超速离心12小时。对于pg水平的核酸沉淀，则应加入tRNA作为载体进行共沉淀。,第三节 DNA的分离纯化,一.真核细胞染色体DNA的制备一切有核细胞都可以用来制备DNA。真核细胞破碎的物理方式包括超声波法、匀浆法、液氮破碎法、氧化铝粉(或石英砂)研磨法等，但这些物理操作均可导致DNA链的断裂。为了获得大分子量的DNA，常用的提取方法是在ED
10、TA和SDS存在下，用蛋白酶K消化细胞，然后用酚/氯仿抽提去除蛋白质，透析除去低分子量杂质，这样得到的DNA大约100-200kb，能够用于Southern杂交分析，以及构建基因组DNA文库。基本方法如下：,（一）样品准备1生物组织：进行大分子DNA分离时最好是新鲜组织，若不能马上进行DNA提取，可将生物组织贮存于液氮中或-70冰箱中。不同的生物体、以及同一生物体的不同组织细胞，其核酸与蛋白质的含量与分布情况不一，选材时应参阅有关研究报导。材料选定后，一般动物组织要先剔除结缔组织、脂肪组织等。植物组织则先去壳、除脂。不同生物组织，因其细胞破碎的难易不一，故使用的处理方法也不同。,表 不同生物组
11、织的处理方法生物组织 一般使用的处理方法1.动物胰脏、肝脏、普通匀浆器研磨脑等较柔软组织肌肉、心脏等较 先绞碎，再制匀浆；韧性组织 或液氮研磨；2.植物肉质组织 一般研磨方法（研钵研磨）加砂研磨;液氮研磨多纤维组织 或使用高速捣碎器,2培养细胞悬浮培养细胞可直接经4，1500g离心10min以收集细胞，对于贴壁培养细胞，用胰酶适当消化后再离心收集，细胞数应在5107左右。用预冷的PBS液洗细胞两次，弃上清收集细胞.。3血液样品将20ml新鲜血液与3.5mlACD抗凝液混匀，0下可保存数天或-70下长期冻存备用。分离抗凝血中的白细胞，用生理盐水或PBS洗涤一次。,（二）DNA提取操作步骤（略）参
12、见书注意事项饱和酚的pH值应接近8.0，所配其它试剂pH值要准确。蛋白酶K在正式使用前应作预试验，确定其活性的大小，否则影响实验结果。所得DNA沉淀不宜完全干燥，否则难以溶解。所得核酸应进行电泳检查或定量检测。,（三）说明1细胞内常存在活性很高的DNA酶，为了避免和钝化DNA酶的作用，溶液中常加入EDTA，SDS以及蛋白酶等。EDTA具有螯合Ca2+和Mg2+的作用，而Ca2+和Mg2+是DNA酶的辅因子。一般DNA抽提液中的EDTA浓度为0.1mol/L，可有效抑制DNA酶且水相易与酚相分层。SDS和蛋白酶则分别具有使DNA酶变性和降解的作用。2制备的DNA样品中也会有RNA杂质，但RNA极
13、易降解，必要时可加入无DNA酶的RNA酶以去除RNA的污染。3从植物细胞中分离DNA始终是一个值得探讨的问题。由于多数植物细胞存在着坚硬的细胞壁，这给细胞的温和裂解带来严重障碍。迄今还未设计出提取植物DNA普遍适用的方案，但已具备许多可应用的提取程序。,二.质粒和噬菌体DNA的提取和纯化（一）质粒DNA的提取基本步骤1.细菌的培养2.细菌的收集与裂解3.质粒DNA的纯化提取方法煮沸法：碱法：最常用的质粒DNA提取方法。SDS法：,（二）噬菌体DNA的提取1.细菌培养2.细菌的感染及裂解3.噬菌体的沉淀及纯化4.噬菌体DNA的提取,图1 玻璃砂研磨提取总DNA的电泳结果1-4孔为低pH值法，5-
14、8孔为CTAB法，9-12孔为苯酚法1,2为西洋参；3.鲜品布渣叶；4.干品布渣叶,图2 氧化铝研磨提取总DNA的电泳结果1-4孔为低pH值法，5-8孔为CTAB法，9-12孔为苯酚法1,2为西洋参；3.鲜品布渣叶；4.干品布渣叶,图3 液氮研磨提取总DNA的电泳结果1-4孔为低pH值法，5-8孔为CTAB法，9-12孔为苯酚法1,2为西洋参；3.鲜品布渣叶；4.干品布渣叶,图4 干燥药材与新鲜药材DNA提取比较1,2.人参（干，鲜品）；3,4.布渣叶（干，鲜品）；5,6.五加皮（干，鲜品）。,图5 植物药材与动物药材DNA提取比较1.川杜仲；2.沉香；3.川红花；4.春砂仁；5.西红花；6.
15、刺桐；7.刁海龙；8.蛤蚧；9.鹿茸；10.羚羊角；11.海蛇；12.盐蛇干,图6 不同提取方法的RAPD扩增图谱1、4：低pH值法；2、5：苯酚法；3、6：CTAB法样品：13：西洋参；46：人参,第四节 RNA的分离纯化,一个典型的哺乳动物细胞含105g RNA，只有15%mRNA，每克细胞可分离出510mg总RNA（相当于108个细胞）。一.RNA提取的原则RNA分离纯化的最关键因素是尽量减少RNA酶的污染。RNA酶，尤其是胰RNA酶是一类生物活性非常稳定的酶类。除细胞内RNase以外，环境中灰尘、各种试验器皿和试剂、人体的汗液、以及唾液中均存在RNase。,RNA酶（RNase)的特点
16、：1.生物活性很稳定，耐热、耐酸、耐碱，煮沸也不能使之完全失活。蛋白质变性剂可使之暂时失活，但变性剂去除后，又可恢复活性。2.其活性不需要辅助因子，EDTA等二价金属离子螯合剂对它的活性无任何影响。3.除细胞内RNase以外，环境中灰尘、各种试验器皿和试剂、人体的汗液、以及唾液中均存在RNase。故在提取RNA时，应尽力创造一个无RNA酶的环境。这主要包括两方面：即尽力避免外源RNA酶的污染和尽力抑制内源性RNA酶的活力。,（一）避免外源性RNA酶的污染整个操作过程中，应戴口罩和手套。因为操作者的手、唾液等含有较丰富的RNA酶。操作应在比较洁净的环境中进行。玻璃器皿常规洗净后，应用0.1%二乙
17、基焦碳酸盐(DEPC)浸泡处理(37，2hr)，再用双蒸灭菌水漂洗几次。高压消毒去除DEPC，然后250烘烤4hr以上或200干烤过夜。塑料器材最好使用灭菌的一次性塑料用品，离心管、微量加样吸头最好是新的，使用前进行高压消毒。,所有溶液应加DEPC至0.050.1%，室温处理过夜，或室温下磁力搅拌20min，然后高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，用经DEPC处理过的无菌蒸馏水配制，然后用滤膜过滤除菌。DEPC易与Tris反应，DEPC在Tris中的半衰期只有1.25分钟，所以配制Tris溶液的水应先用0.1%DEPC处理然后高压消毒，配好后再经高压消毒。严格地说，RNA提取所使用
18、的酚，应该单独配制和使用，在配制饱和酚用的缓冲液时，使用的水应预先用DEPC处理并高压消毒，酚饱和后，加入8-羟基喹啉至0.1%，不但抗氧化，且有一定的RNA酶抑制作用。,试验中使用的甲酰胺，应用5%（W/V）的AG501-X8(D)树脂彻底去离子，Whatman1号滤纸过滤后，然后以0.45um的滤膜过滤除菌。所用的化学试剂应为新包装，称量时使用干烤处理的称量勺。所有操作均应在冰浴中进行，低温条件可减低RNA酶的活性。说明：焦碳酸二乙酯(DEPC)，为粘性液体，是很强的核酸酶抑制剂。作用机制是通过与蛋白质中的组氨酸结合，使蛋白质变性。DEPC不能用聚苯乙烯器皿存放。保存在4或液氮中，可防止D
19、EPC降解。DEPC与0.11mg/ml的肝素联合使用，具有极强的RNA酶抑制效果。DEPC在Tris中，易分解成为CO2和乙醇，使pH值下降。,（二）抑制内源性RNA酶的活性在细胞裂解的同时，RNA酶释放出来，这种内源性的RNA酶是降解RNA的主要危险之一。所以原则上要尽可能早地去除细胞内蛋白，加入RNA酶抑制剂，力争在提取的起始阶段对RNA酶活力进行有效的抑制。不同组织细胞中内源性RNA酶的数量和活性不同，胰腺、脾组织细胞中RNA酶的含量极为丰富，在RNA提取时需要联合使用强有力的RNA酶抑制剂。在实验中经常使用的RNA酶抑制剂主要有以下几种：DEPC和肝素,胍类解偶剂异硫氰酸胍，目前认为
20、是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。异硫氰酸胍和盐酸胍是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，并使蛋白质二级结构消失，细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离，所以又称解偶剂。利用它们可从胰腺这样富含RNA酶的组织细胞中分离出完整的RNA分子，故目前这类物质成为制备RNA的常规试剂。,RNA酶的特异抑制剂主要包括RNA酶阻抑蛋白(RNasin)和氧钒核糖核苷复合物两种物质。a.RNA酶阻抑蛋白(RNasin)是一类从大鼠肝或人胎盘中提取出来的酸性糖蛋白，可与RNA酶结合，从而抑制其活性。RNasin最好不要与某些蛋白质变性剂(如尿素)同时使用，因为尿素能使RNasin-RN
21、ase复合物分离，并释放出活性的RNase。RNasin对其它核酸工具酶无影响，对RNA酶有强的特异性抑制效果，很容易被酚抽提除去，故应用日益广泛。该制品反复冻融或贮存于有氧化剂的溶液中极易被破坏，不宜继续使用。b.氧钒核糖核苷复合物是由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合后，几乎可完全抑制RNA酶的活性。在RNA制备中，使用浓度一般为10mmol/L，提取的mRNA产量很高，其质量可满足反转录实验的要求。可用酚反复抽提以去除之。,其它如酚、氯仿和去污剂(如SDS)、蛋白酶K、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定的抑制作用。,二.RNA提取和纯化的方法提取mRNA一般有两条途径。其一是先
22、提取多聚核糖体，再将蛋白质与mRNA分开。利用抗原抗体的反应，可将含量极微的、特异的mRNA提取出来。因为没有合成完的蛋白质还停留在多聚核糖体上。这些新生肽链能与完整蛋白质的抗体发生抗原抗体反应，因此可选择性沉淀特异的mRNA。其二是提取细胞总RNA，利用寡聚纤维素柱层析，把mRNA与其它的RNA分开。因为几乎所有的mRNA的3-端都具有poly（A）的序列，而其它RNA却没有这样的结构。进行纤维素柱层析时，只有3端有poly（A）的mRNA才结合在柱上，从而达到与其它RNA分离的目的。,现将提取培养细胞总RNA的常规方法简介如下，该法制备的RNA，操作得当，应无DNA和蛋白污染，可直接用于N
23、orthern印迹分析、cDNA合成和体外转录。(一）RNA提取1.材料和仪器：高速混匀器；高速冷冻离心机2.操作步骤详见书page98,（二）注意事项1.所有操作注意在无RNase的环境中进行。2.RNA沉淀不宜完全干燥，否则沉淀难以溶解。3.纯RNA样品的A260/A280比值为1.72.0，若低于该值，表明存在蛋白质污染，可重新用酚/氯仿抽提。4.RNA完整性的检测可通过琼脂糖凝胶电泳。28S和18S真核细胞RNA比值约为2:1，表明无RNA降解。如该比值逆转，则表明有RNA降解。,图5 人外周血单个核细胞总RNA提取结果1.2.3.为人外周血单个核细胞提取的总RNA；4.5.为培养的J774细胞提取的总RNA；6.为Marker,图6 人 IL-1和COX-2基因的表达(RT-PCR结果）提取人外周血单个核细胞总RNA作为扩增模板,图7 不同方法提取的人外周血单个核细胞总RNA和DNA,
