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1、实验六 氨基转换作用,实验原理,体内-氨基酸的-氨基在氨基转换酶的作用下，移换至-酮酸的过程，称氨基转换作用。,转氨酶(aminotransferase),转换酶中的一类。催化氨基酸和a-酮酸 或醛酸之间的氨基转换反应，生成与原来的a-酮酸或醛酸相应的a-氨基酸或-氨基酸，原来氨基酸转变成相应的酮酸。转氨酶催化的反应都是可逆的。,转氨酶参与氨基酸的分解和合成，是人体代谢过程中必不可少的“催化剂”；以谷丙转氨酶（GPT）和谷草转氨酶（GOT）最为重要。GPT 主要存在于肝脏、心脏和骨骼肌中，在肝脏中活力最大。GPT升高是肝脏功能出现问题的一个重要指标。,本实验是将谷氨酸与丙酮酸在肌肉糜中谷氨酸丙
2、酮酸氨基转换酶（简称谷丙转氨酶）的作用下进行氨基转化反应，然后用纸层析法检查反应体系中丙氨酸的生成。,谷丙转氨酶,L谷氨酸,丙酮酸,-酮戊二酸,L丙氨酸,1,在反应体系中添加溴乙酸以抑制谷氨酸和丙酮酸的其他代谢过程。谷氨酸、丙酮酸（丙酮酸羧化酶系）糖异生途径谷氨酸、草酰乙酸在谷草转氨酶（GOT）催化转氨基生成天冬氨酸。丙酮酸：丙酮酸脱氢酶系催化生成乙酰辅酶A，进入TCA循环。,试剂和器材,试剂1%谷氨酸溶液（用1%KOH调到中性）；1%丙酮酸钠溶液（用1%KOH调到中性）；0.1%KHCO3溶液；0.025 溴醋酸溶液（用1%KOH调到中性）；2%Hac溶液；0.1%标准谷氨酸；0.1%标准丙
3、氨酸。展开剂：酚饱和水溶液：2份酚加1份水混合放入分液漏斗，振荡。静置24小时 显色剂：0.1%茚三酮正丁醇溶液。,材料 肌肉糜：取兔子肌肉1g，置研钵中，加0.9%氯化钠溶液3ml，在低温下研磨成细浆，离心5分钟（3000转/分），弃去沉淀，得肌肉糜提取液。,操作方法,一、转氨酶作用 1、取试管2只编号（1、2），向每个试管各加0.5mL 1%谷氨酸溶液,0.5mL 1%丙酮酸钠溶液,0.5mL 0.1%KHCO3和0.25mL 0.025%溴醋酸,混匀。然后分别加入肌肉糜提取液0.5ml，混匀，将其中一试管立即在沸水浴中加热2-3分钟做对照。用试管帽塞住另一只试管，置于45水浴中 保温40
4、min。2.保温完毕，取出试管。向每只试管中各加2%HAc溶液4滴，再置于沸水浴中2min，使蛋白质完全沉淀。过滤收集滤液待用。,二、层析验证 1.取9厘米培养皿一个，加入酚饱和水溶液约0.5cm高，取圆形滤纸一张，在中心剪一直径约2mm的小孔，并以圆心约1cm为半径划一圆作为底线。在此底线上，用铅笔点四个等距离的原点并标明1，2，3，4；2.用毛细管分别吸取以上两种滤液及标准谷氨酸、丙氨酸，依次点在标明号码的原点处，点样2-3次。注意斑点不能太大，一般直径约0.2cm为宜。3.另取一条滤纸卷成实心筒状，直径约23mm,将此小筒插入滤纸中心小孔（不可突出纸面之上），使层析滤纸通过此小筒与酚溶液相连。然后将滤纸平放在盛饱和酚的培养皿上。另取一大小相同的培养皿盖在滤纸上，此时酚溶液即由滤纸中心孔向四周扩散。,4.当酚溶液扩展到直径约7cm时，取出滤纸。用铅笔画下酚溶液扩展边缘，用吹风机吹干。用喷雾器喷以0.1%茚三酮正丁醇溶液，再用热风吹干。用铅笔圈下各显色点。测定各显色点的Rf 值，并解释之。注意:当温度、滤纸质量和展开剂等都相同时，对于一个化合物比移值Rf是一个特有的常数。,三、计算公式,Rf原点至斑点中心的距离/原点至溶剂前沿的距离,1.什么叫转氨作用？2.根据所学理论阐明转氨作用在蛋白质的合成与分解及糖、脂肪代谢中有何作用？,思考题,重要通知下次实验课的安排具体见公告栏,
