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1、第四次实验课内容1、细菌代谢产物检查（示教）2、肠道杆菌在选择鉴别培养基的生长情况（示教）SS平板、双糖铁培养基3、肥达试验（结果示教）,实验一 细菌代谢产物检查,细菌具有不同的代谢酶系统，因此对营养物质的利用与分解能力也各不相同，可形成不同的中间代谢产物与终末代谢产物。根据细菌的代谢能力及其产物不同鉴别细菌，称为细菌的生化反应。本实验通过介绍常用生化反应的经典试验方法，以了解细菌生化反应的机制与实验原理。,原理：,染色镜检普通琼脂平板中菌落的形态,不能鉴别,能够鉴别,实验一 细菌代谢产物检查,细菌代谢产物,分解代谢产物,合成代谢产物,生化反应,?,细菌菌落的色素观察,金黄色葡萄球菌：产生只局
2、限于菌落的脂溶性金黄色色素。铜绿假单胞菌：产生带荧光的水溶性色素，该色素可扩散至菌落周围，使培养基呈亮绿色。,金黄色葡萄球菌,铜绿假单胞菌,细菌菌落的溶血现象观察,乙型溶血性链球菌:透明的无色溶血环。,一、糖发酵试验,1.了解糖发酵的原理和在肠道细菌鉴定中的重要作用。2.掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。,基本原理,糖发酵试验是最常用的生化反应，在肠道细菌的鉴定上尤为重要。绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源，但是它们在分解糖的能力上有很大的差异，有些细菌能分解某种糖并产酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和气体（如氢、甲烷、二氧化碳等）；有些细菌只产酸不产气。例如大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产
3、气；痢疾杆菌能分解葡萄糖产酸不产气，不能分解乳糖；乙型副伤寒杆菌分解葡萄糖产酸产气，不能分解乳糖。,基本原理,酸的产生可利用指示剂来断定。在配制培养基时预先加入溴甲酚紫Ph5.2（黄色）-6.8（紫色），当发酵产酸时，可使培养基由紫色变为黄色。气体的产生可由发酵管中倒置的德汉氏小管中有无气泡来证明。,糖发酵试验：,葡萄糖发酵试验：,四、操作步骤,1、编号 用记号笔在各试管上分别标明发酵培养基名称和所接种的菌名。2、接种 取盛有葡萄糖发酵培养基的试管3支，分别接种大肠杆菌、痢疾杆菌、乙型副伤寒杆菌。另取乳糖发酵培养基试管3支，分别接种这三种细菌。3将上述已接种的葡萄糖和乳糖发酵试管和对照管置37
4、温室中培养24小时。,图1 糖类发酵试验,观察结果:,观察结果时，看各管颜色变化及杜氏小管有无气泡。产酸产气用“”表示；只产酸不产气用“+”表示；不产酸也不产气用“”表示。,二、靛基质（吲哚）产生试验(I)原理：分解蛋白胨内的色氨酸形成靛基质（无色）靛基质与靛基质试剂中的对二甲基氨基苯甲 醛结合而显红色(玫瑰吲哚)材料：蛋白胨水培养基（氯化钠、蛋白胨、蒸馏水）,方法：约0.3ml的靛基质试剂徐徐加入细菌蛋白胨水培养物 注：加入吲哚试剂后切勿摇晃结果：大肠杆菌()红色 痢疾杆菌()黄色 乙型副伤寒杆菌()黄色,红色吲哚,大肠杆菌,产气杆菌,分 解,六、硫化氢产生试验 原理：材料：醋酸铅培养基（普
5、通琼脂培养基、硫代硫酸钠溶液、醋酸铅溶液）,含硫氨基酸,硫化氢,遇铅盐或亚铁盐,黑褐色沉淀,方法：结果：乙型副伤寒，黑褐色 大肠埃希菌，不变色,乙型副伤寒,大肠杆菌,（21）半固体培养基(动力试验),大肠埃希菌 志贺菌 伤寒沙门菌,材料：1、EMB培养基、SS琼脂平板、双糖铁培养基2、大肠埃希菌、伤寒沙门菌、志贺菌,选择培养基,肠道杆菌在选择鉴别培养基的生长情况,鉴别培养基,SS培养基（Salmonella Shigella Agar Medium）,原理：（SS平板）非致病菌：,致病菌：,不分解乳糖，菌落呈透明无色；枸橼酸铁能指示硫化氢的产生，使菌落中心呈黑色,注意：非致病菌并非被杀灭，故挑
6、病原菌菌落时，尽量挑取菌落中心部分,大肠埃希菌,痢疾志贺菌,大肠埃希菌与伤寒沙门菌,双糖铁培养基（Double sugar Iron Medium）成分 含酚红指示剂的pH7.6的蛋白胨水 500mL 琼脂(1.3%)6.5g 乳糖(1%)5g 葡萄糖(0.1%)0.5g 硫酸亚铁铵(0.02%)0.1g 硫代硫酸钠(0.02%)0.1g用途 初步鉴别肠道杆菌,原理：只分解葡萄糖：产少量酸 上层培养基的酸+O2CO2+H2O 蛋白胨代谢产物 下层培养基不接触空气培养基呈酸性显黄色葡萄糖、乳糖都分解硫酸亚铁铵：用以检查细菌分解蛋白质后是否产生硫化氢。,只产酸产酸&产气,培养基略变碱,指示剂变红,
7、肠道杆菌的生长结果,SS 双糖铁大肠埃希菌 粉红色大菌落 黄色痢疾志贺菌 无色细小 上红下黄 半透明菌落伤寒沙门菌 无色细小 上红下黄 半透明菌落 黑色沉淀,检测试剂的成分,病人体内的反应,伤寒或副伤寒病人,O抗原H抗原,含有伤寒沙门菌O抗原伤寒沙门菌H抗原甲型副伤寒沙门菌H抗原乙型副伤寒沙门菌H抗原,肥达试验（Widal test）,材料,伤寒沙门菌O、H菌液，甲型副伤寒沙门菌H菌液和乙型副伤寒沙门菌H菌液。生理盐水和患者血清（1:20稀释），微量反应板，1ml吸管，52水浴箱,方法,取46孔反应板，孔横向4排，纵列6列，依次编号。于第2、3、4、5、6列每孔内加入生理盐水0.2ml。于第1
8、、2列在每孔内加入稀释度为1：20的受检血清0.2ml，从第2列开始进行倍比稀释。每排加入诊断菌液0.2ml轻轻振荡混匀后，水浴箱孵育2小时,弃去0.2ml,效价的判定,结果观察,+清澈透明，菌体形成凝块于管底+较透明，大部分菌体形成凝块于管底+稍浑浊，较多细小凝集+较浑浊，有细小凝集 浑浊，无凝集血清凝集效价：(抗体滴度)与定量Ag产生明显凝集（+）的血清最高稀释倍数,参考值 伤寒杆菌凝集价H1：160，O1：80；副伤寒凝集价A1：80，B1：80，C1：80,临床意义机体感染伤寒、副伤寒杆菌后会产生相应抗体，正常人因隐性感染或预防接种，血清中可含有一定量的抗体。一般当H1：160，O1：
9、80，副伤寒凝集价1：80时，才有诊断意义。病程中应每周复查一次，如病人H与O的凝集价均高于参考值或较原凝集价升高4倍以上，则患伤寒的可能性很大。若H凝集价高而O低于正常值，则可能是以往预防接种疫苗的结果或非特异性回忆反应所致。,O抗原 沙门菌属间有交叉反应 IgMH抗原 种特异性-伤寒沙门菌 IgG 甲型副伤寒沙门菌 乙型副伤寒沙门菌,结果分析,O与H抗体的诊断意义,O抗体：IgMH抗体：IgG,一般认为O抗体效价在1：80以上，H抗体效价在1：160以上，有辅助诊断意义。但在分析结果时，应注意以下两点：（1）非肠热症患者，由于曾接种过伤寒，副伤寒疫苗或以往在流行区有过隐性感染或患过伤寒，副伤寒，以及回忆反应等原因，也可呈现阳性结果。不过，由这些原因所引起的阳性反应主要是H抗体升高，O抗体效价一般不高，同时，每隔57天试血一次，其抗体效价一般不会随病程而升高。上述这些都有别于现症感染。,（2）少数肠热症患者，由于发病初期曾使用大量抗生素，或机体有免疫缺陷病，或机机反应性极弱等原因，抗体效价可以很低，甚至为阴性结果。因此不能只根据肥达氏试验的结果去作简单肯定或否定的结论，必须结合当地流行情况，既往接触史，以及临床症状和体征，作出正确的判断。,谢谢大家！,
