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1、蛋白质研究技术平台,梁洁开放实验室,蛋白质相关技术,蛋白质样品的制备蛋白质浓度的测定蛋白质免疫印迹（western blot)蛋白质相互作用研究,蛋白质样品制备,单层贴壁细胞总蛋白的提取：(1)收集细胞（1*106以上）(2)加入适量含蛋白酶抑制剂的裂解液(3)冰上裂解(4)4下12000rpm离心5min,取上清，-20 保存组织中总蛋白的提取(1)取组织块（约0.1g)剪碎,加液氮磨碎、匀浆、超声处理(2)4下12000rpm离心15min,取上清，-20 保存(3)膜蛋白需用更剧烈的方法抽提，低丰度膜蛋白可能还要超滤(4)组织中的蛋白酶活性更强，需要注意抑制蛋白酶的活性,蛋白质样品制备试
2、剂,RIPA裂解配方：50 mM Tris-HCl pH 7.4、150 mM NaCl、1 mM PMSF、1 mM EDTA、1%Triton x-100、1%脱氧胆酸钠、0.1%SDS蛋白酶抑制剂：1 mM PMSF,Aprotinin 1g/ml,Leupeptin 5g/ml,pepestatin 1g/ml,AEBSF 50g/ml,Bestatin 10g/ml,E-64 1g/mlPMSF 储存液：溶于异丙醇1.74mg/ml(10mmol/L)或17.4mg/ml(100mmol/L),分装后保存于-20，使用时稀释至1mmol/L，现用现加。,各种细胞裂解液比较,蛋白质测定
3、方法比较,蛋白质浓度测定,Bradford法测定蛋白质浓度试剂 G250考马斯亮蓝溶液：0.15 mol/L NaCl：1mg/ml 牛血清白蛋白（BSA）标准曲线,R2=0.999,Bradford蛋白浓度测定试剂盒,1.完全溶解蛋白标准品，取10l稀释至100l，使终浓度为0.5mg/ml。可以用0.9%NaCl或PBS稀释标准品。2.将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20微升分别加到96孔板中，加标准品稀释液补足到20微升。3.加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加标准品稀释液到20微升。4.各孔加入200微升G250染色液，室温放置3-5分钟。5.用酶标仪测定A595，或560
4、-610nm之间的其它波长的吸光度。6.根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度。,蛋白质核酸测定仪,蛋白质免疫印迹(WB)原理,protein,http:/id/protein/western-blot/,蛋白质免疫印迹（WB)过程,Figure1.SDS-PAGE,蛋白质免疫印迹（WB)过程,Figure2.Western Blot,SDS-PAGE所需仪器,蛋白质电泳仪,SDS聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE)的有效分离范围,配胶所需材料,蛋白质转印槽,半干转印槽,浸渍转印槽,半干法转移槽使用说明,膜,滤纸,胶,滤纸,正极,负极,Western blot 所需材料,还原型5SDS上样缓冲液 5
5、电泳液缓冲液浸渍式转移缓冲液或半干式转移缓冲液TBST或PBST缓冲液封闭液（抗体稀释液）洗脱抗体缓冲液化学发光试剂（ECL）显影液和定影液抗体Mark,Western blot 操作流程,配胶：根据蛋白质分子量配制相应浓度的SDS-PAGE电泳：以5100g蛋白量上样，电泳至溴酚兰跑到底部。转印：剪下适当大小的PVDF膜，把胶铺在负极滤纸上，上面小心覆盖泡好的PVDF膜，夹好后倒入电转缓冲液，加入冰格，100V转移1小时。封闭：膜加封闭液（5脱脂牛奶in TBS-T）,室温1h.抗体孵育：加一抗（1：1000）4孵育过夜，TBST洗三次，3x10min；加二抗（1：20000）室温1h，TB
6、S-T洗三次，3x10min；显影：膜上加同体积ECL A，B液（100l/cm2),依照荧光强度而定曝光时间，显影1、5、15min,定影10min.保存：X-胶片干后，将分子量和加样顺序标记上，把日期，抗体名称，孵育时间写上。把膜保存在20以备以后使用。,纹理和脱尾现象：样品溶解不佳，加样前离心蛋白带过宽：邻近泳道的蛋白加样量过多指示剂成微笑符号：凝胶不均匀冷却指示剂成哭泣符号：凝胶和玻璃板组成“三明治”底部有气泡凝胶时间不对：凝胶太慢可能是TEMED、APS剂量不足或失效；凝胶太快：TEMED、APS用量过多，胶太硬易裂,SDS-PAGE 常见问题,Western blot 常见问题,1
7、、技术问题（1）电泳（2）转膜2、抗体问题（特异性、浓度）3、蛋白质丰度4、荧光淬灭（蛋白量过大）,1、背景过深2、抗体特异性3、洗膜时间,Western blot 常见问题,Western blot 常见问题,1、加样量2、ECL试剂3、曝光时间,Western blot 常见问题,1、蛋白质降解2、蛋白质分子量,内参,Western blot常见问题,4#：加样量过多,Western blot常见问题,免疫组化和Western Blot可以用同一种抗体吗？解答：免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇（又称表位），有些表位是线性的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋
8、白和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间结构限制，煮后变性会消失。如果抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和Western，而如果抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化。一般抗体说明书上都有注明此种抗体识别的氨基酸区间。,在做Western Blot时，PBDF膜用甲醇浸泡的目的？解答：PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。,Western blot常见问题,不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上，转移效率低怎么样解决？解答：可以考虑：转移缓冲液中加入
9、20%甲醇（是指终浓度）(优化的转移缓冲液，可以参考蛋白质技术手册)，因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率，但可增加蛋白质和PVDF膜的结合能力，甲醇可以防止凝胶变形，甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间；转移缓冲液加入终浓度0.1%SDS，也是为了增加转移效率；用优质的转移膜，或使用小孔径的NC膜（0.2微米）；使用戊二醛交联；低浓度胶，如低至6。太大时还可以考虑用琼脂糖胶；提高转移电压电流；增加转移时间。,Western blot常见问题,蛋白分子量大小分别为21kd、28kd，用的是湿转，请问多大电流，多长时间比较合适？解答：分子量比较小，最好是用干转，湿转效率太高，易转过了。干转的话，用2.5
10、A/cm2，30min就应该够了。湿转，按照bio-rad的说明，用100mA，也得要半个多小时吧。,Western blot常见问题,怎样才能把胶跑的非常漂亮，泳道和band都能很直?影响跑胶跑的质量，有以下几个因素：1、电压，小的电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥。电压越小，条带越漂亮，浓缩胶80v，分离胶100v就能跑得很好。2、胶的均匀度，胶越均匀，条带越窄，分离越均匀。倒胶之前，一定要充分混匀，玻璃板一定要干净，双蒸水隔离时，一定要比较轻地加上去，避免稀释下层的分离胶。,Western blot常见问题,Western blot结果如何分析,目的蛋白110kd,Thank you!,
