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1、蛋白质药物的PEG化学修饰胡 涛,中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室,1.迅速被体内酶降解2.肾小球过滤清除3.抗原抗体反应4.溶解度差导致沉淀,蛋白质药物在使用中出现的问题,体外聚乙二醇修饰（PEG化）,(1)增大药物分子量，避免被肾小球过滤(2)阻碍蛋白酶的降解作用(3)屏蔽药物的免疫位点(4)增加药物在体液中的溶解度(5)与药物间的化学键在体内随时间水解，缓慢释放药物,+,蛋白或多肽,偶联物,聚乙二醇,CH3(-O-CH-CH)n-OH,生物医药生物能源生物材料生物化学品其它产品,生化工程（生物化学工程，Biochemical Engineering）,目 录,PEG修饰的国
2、内外研究进展 PEG修饰剂的研发 PEG修饰方法 PEG修饰工艺的优化 PEG修饰产物的质量控制,一、PEG修饰的国内外研究进展,国际上PEG修饰技术的研究进展,美国Rutgers大学Davis教授70年代的工作甲氧基PEG的应用美国Enzon公司美国最早从事PEG修饰蛋白质药物的公司美国Shearwaters公司各种PEG修饰剂的生产商美国罗氏、先灵宝雅、安进PEG药物：PEG-INF，PEG-G-CSF其它：辉瑞、默克、葛兰素史克、施贵宝。,国内PEG修饰技术的研究进展,国家863重大机密项目：人工血液代用品的研制，1997-2000中国科学院重点项目：血液代用品和血液净化，2001-20
3、05国家重大科技专项课题创新药物和中药现代化：长效基因工程蛋白质和多肽制剂关键技术，2002-2005国家863重点项目课题：核酸和多肽的修饰和剂型化技术，2007-2010PEG修饰血红蛋白：I 期临床（中科院过程所、凯正公司）PEG修饰G-CSF：III 期临床（格兰百克）,修饰粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）延长半衰期修饰人肿瘤坏死因子消除副作用修饰白介素I受体拮抗剂（rhIL-1Ra）延长半衰期修饰牛胰核糖核酸酶（RNase）提高抗肿瘤活性修饰超氧化物歧化酶（SOD）提高半衰期修饰天冬酰氨酶（Aspartase）克服免疫原性提高半衰期修饰人干扰素（IFN）提高半衰期修饰血红蛋白（H
4、b）血液代用品修饰胰岛素提高半衰期,我国在PEG修饰蛋白质方面的一些工作,二、PEG修饰剂的研发,Sc-PEG 专利分析,以PEG-OH为原料的必然途径,CH3OCH2CH2(OCH2CH2)nOH+光气+NHS,CH3OCH2CH2(OCH2CH2)nO-C-O-N+NH2G-CSF,CH3OCH2CH2(OCH2CH2)nO-C-NHG-CSF,O,单链修饰：,(SC-PEG),Roche公司的长效干扰素产品专利分析,同样是以PEG-OH为原料的必然途径,双链修饰：,新的修饰策略,采用新方法制备新的修饰剂,以PEG-COOH（CM-PEG)为原料的必然途径，已获专利,CH3(OCH2CH2
5、)nOCH2CH2OH,CH3(OCH2CH2)nO-CH2C-O-N+NH2G-CSF,单链修饰：,CH3(OCH2CH2)nOCH2COOH,CH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NHG-CSF,O,(CM-PEG),我们的策略,以PEG-COOH为原料的必然途径,CH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NH,O,O,O,双链修饰：,CH3(OCH2CH2)nOCH2COOH+Lysine,O,CH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NH-,O,(CH2)3,CH2,CH-C-O-N,+NH2IFN,CH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NH,O,O,CH3(OCH2CH2)nO-CH
6、2C-NH-,O,(CH2)3,CH2,CH-C-NH,IFN,1、PEG修饰剂的批量制备取得了成功,取 得 的 主 要 进 展,聚乙二醇修饰剂产品,三、药用蛋白的PEG修饰方法,创新技术（反应器技术和产物移走技术）,振荡反应器,流加反应器,缓释反应器,固相反应方式,膜耦合反应方式,双水相反应方式,Q.Yun,R.Yang,T.Chen,J.Bi,G.Ma,Z Su.J.Biotechnology,2005,118:67-74,中国发明专利，申请号200510114930.0 中国发明专利，申请号0410029577,1.修饰反应器设计PEG-pellet 反应器,2.固相吸附法制备PEG修饰
7、蛋白,固相吸附法与液相吸附法的比较,1峰：原蛋白；2峰：单修饰蛋白；3峰：多修饰蛋白,PEG-INF的制备过程,G-CSF,PEG-G-CSF,3.PEG醛制备单修饰的药用蛋白,粒细胞集落刺激因子(G-CSF),MW:18.8kd(174 amino acids)pI:6.1,1 thiol,1 N-terminal,4 lysines,Half life:5 h,Weekly injection:7 times,三批PEG30-rhG-CSF产品的制备,取 得 的 主 要 进 展,PEG化重组人生长激素，批产量1-10g；PEG化降纤酶，批产量6000支；环孢素A眼用微乳制剂，批产量5000
8、支,PEG化G-CSF,2L修饰反应器计算机程序控制批产量3g生产周期10天,修饰和剂型化产品质量达到国际先进水平,生产规模产品质量批次稳定性,1 2 3,1,2,3,1,2,3,(A),(B),(C),以分子量为30kDa的PEG修饰rhG-CSF为例：(A)三批产品的SDS-PAGE检测图谱(B)三批产品的高效凝胶过滤检测图谱(C)三批产品的园二色检测图谱,4.引入巯基的方法制备PEG修饰蛋白,(2)PEGylation,S,NH,+,(1)Thiolation,HS-(CH2)3-C-NH-Hb,N,O,O,PEG,-S-(CH2)3-C-NH-Hb,O,PEG,N,O,2-iminot
9、hiolane,NH2-Hb,Sangart公司是一家私营的生物制药公司，主要从事氧载体的研发和产业化,Hemospan-MP4,Phase I Sweden Status:CompletePhase Ib/II Sweden Status:CompletePhase II Sweden Status:Complete Phase II USA Status:Enrollment Complete Phase III Europe Status:Enrollment Complete,该PEG修饰产物的凝胶过滤分析,四、PEG修饰工艺的优化,PEG修饰反应参数的优化,建立反应动力学，包括位点反
10、应动力学和蛋白分 子反应动力学，优化反应时间 优化反应的pH值 优化PEG与蛋白的摩尔比 优化反应体系,蛋白分子的修饰反应动力学,Weijun Li,Zhiguo Su.Quantitatively investigating monomethoxypolyethylene glycol modification of protein by capillary electrophoresis,J.Biochem.Biophys.Methods.2004，59:65-74,PEG修饰的位点反应动力学,PEG醛修饰药用蛋白的优化反应,单修饰产物的分离纯化,P1 P2,分离产物分析,P1凝胶过滤分析
11、,膜耦合修饰工艺制备PEG化药用蛋白,五、PEG修饰产物的质量控制,IEF和SDS-PAGE鉴定PEG修饰蛋白,1,2,3,4,+,-,Iodine stain,Comassie blue stain,SDS-PAGE,IEF,1:Marker,2:HbA,3:-Hb 4:(Propyl-PEG5K)6-Hb5:(Propyl-PEG5K)6-Hb,1:HbA,2:-Hb 3:(Propyl-PEG5K)6-Hb4:(Propyl-PEG5K)6-Hb,RP-HPLC分析胰蛋白酶切片段,质谱分析胰蛋白酶切片段,MALDI-TOF/TOF分析PEG修饰位点在Val-1(),PEG修饰蛋白的结构鉴
12、定,圆二色光谱鉴定,荧光光谱鉴定,RP-HPLC分析PEG修饰蛋白,蛋白质修饰剂及其制备方法和用途,中国发明专利，ZL01141745.5 制备分枝型聚乙二醇的新方法,中国发明专利，ZL02120740.2 带PEG长尾的蛋白质修饰剂的制法和用途,中国发明专利，ZL031100736.8 聚乙二醇羧酸的制备方法和其用途,中国发明专利，ZL 200310113367.6 重组人复合干扰素-聚乙二醇偶联物的制备及其偶联产物,中国发明专利，ZL 200410029577.1 一种蛋白质交联剂及其交联方法,中国发明专利，ZL 03105003.4 一种分级分离制备血红蛋白偶联物的方法,中国发明专利，Z
13、L 99106228.0 一种二醇聚合物动物血红蛋白偶联物的制备方法,中国发明专利，ZL 99106229.9 一种二醇聚合物动物血清白蛋白偶联物的制备方法,中国发明专利 ZL 00123696.2 分子量均一的聚合物血红蛋白的制备方法,中国发明专利 ZL 01136190.5.血红蛋白-人血清白蛋白偶联物制备血液代用品及其制备方法,中国发明专利，ZL 03109622.0,蛋白质修饰国家发明专利11项（已授权）,PEG修饰的SCI论文,Q Yun,T Chen,G Zhang,J Bi,G Ma,Z Su.A novel polyethylene glycol derivative suit
14、able for the preparation of mono-PEGylated protein.Biotech Lett,27,213-217,2005 Q Yun,R Yang,T Chen,J Bi,G Ma,Z Su.Reproducible preparation and effective separation of PEGylated recombinant human granulocyte colony-stimulating factor with novel“PEG-pellet”PEGylation mode and ion-exchange chromatogra
15、phy.J Biotech.2005,118:67-74 Q Yun,M He,W Xing,J Bi,G Ma,Z Su,A novel tetrafunctional reagent for simultaneous intramolecular and intermolecular cross-linking of bovine hemoglobin,Biotech Lett 26:1359-1363,2004.X Li,F Meng,G Ma,Z Su,A simple and efficient method for synthesis of carboxymethylated po
16、lyethyleneglycol.J Chem Res,In press.J Zhang,Y Zhao,Z Su,G Ma,Synthesis of Monomethoxy Poly(ethylene glycol)without Diol Poly(ethylene glycol),J Appl Polym Sci,105,37803786(2007).J Zhang,Z Su,G Ma,Synthesis and Characterization of Hetetotelechelic poly(ethylene glycol)s with amino acid at one end an
17、d hydroxyl group at another end,J Appl Polym Sci,in press.C Zheng,J Bi,G Ma,Z Su,Polyethylene Glycol Improves Conjugation of Bovine Hemoglobin and Human Serum Albumin in a Controlled Ratio,Artificial Cells,Blood Substitutes,and Biotechnology,35:568584,2007.C Zheng,G Ma,Zhiguo Su,Native PAGE eliminates the problem of PEG-SDS interaction in SDS-PAGE and provides an alternative to HPLC in characterization of protein PEGylation,Electrophoresis,2007,28:2801-2807,谢谢大家！,
