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1、DNA的粗提取和鉴定,专题5 DNA和蛋白质技术,核心要点：,1、DNA从哪提取？2、怎样将DNA与细胞中的其他物质分离？3、怎样鉴定我们提取的DNA？,1.DNA在NaCl溶液中的溶解度，是随着NaCl的浓度的变化而改变的。当NaCl的物质的量浓度为0.14 molL时,DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。2.DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA。3.DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂,实验原理,实验材料和用具,实验材料：1、鸡血细胞液（510
2、ml）；2、体积分数为95%的冷酒精溶液（实验前置于冰箱内冷却 24h）；3、蒸馏水；4、质量浓度为0g/ml的柠檬酸钠溶液；（抗凝剂）5、物质的量浓度分别为2mol/L和0015mol/L的NaCl溶液；6、二苯胺试剂。,实验用具：铁架台；铁环；镊子；三角架；酒精灯；石棉网；载玻片；玻璃棒；滤纸；滴管；量筒（100ml，一个）；烧杯；（100ml，一个，50ml、500ml各二个）；试管（20ml，二个）；漏斗；试管夹；纱布。,二、DNA的粗提取与鉴定的实验设计,（一）实验材料的选取,材料：新鲜的鸡血,注意：本实验中，要往鸡血中加入抗凝剂（柠檬酸钠溶液）,原则上只要含DNA的生物材料都可以，
3、但是选取DNA含量相对较高的生物组织，成功率更大。,(1)先将新鲜的鸡血离心，获得鸡血细胞,（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液,1、破碎细胞,讨论：提取鸡血中的DNA时，为什么除去血液中的上清液？,答：血液分为两部分，一部分是血浆，一部分是血细胞，离心后除去的上清液是血浆，血浆中没有DNA，但有很多杂质,(1)先将新鲜的鸡血离心，获得鸡血细胞(2)在鸡血细胞中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可,（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液,1、破碎细胞,讨论：,答：让细胞内浓度大于周围溶液的浓度，细胞会吸水以至胀破,（1）为什么要加入蒸馏水？加入蒸馏水后细胞会有什么变化？,（2）用
4、玻璃棒搅拌有什么意义？,答：用玻璃棒搅拌可以加速血细胞和细胞核的破裂。注意应沿一个方向快速搅拌，但也不能太快太猛，防止打碎DNA,（3）滤去的是什么物质？得到的是什么？,答：过滤将滤去的是细胞膜和核膜等物质；得到的是与蛋白质等物质结合在一起的DNA,（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液,为了纯化提取的DNA需要将滤液作进一步处理,讨论：此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？,答：可能含有蛋白质和RNA等杂质,（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液,讨论：为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质,答：用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐
5、溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质,（三）除去滤液中的杂质,方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开；方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离 方案二利用了酶的专一性；方案三利用了DNA的稳定性。,（三）除去滤液中的杂质,（四）DNA的析出与鉴定,DNA的析出用的是与滤液体积相等的冷却的酒精溶液（体积分数为95），静置2-3min，溶液中会出现白色丝状物，这就是粗提取DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水,1、DNA的析出,答：因为DNA不溶于冷酒精，而其他物
6、质可以溶解在酒精中，使含杂质较少的DNA丝状物可以析出,悬浮于溶液中,讨论：,（2）观察丝状物呈什么颜色？,答：白色,（1）为什么要加50mL的冷酒精？,（四）DNA的析出与鉴定,（四）DNA的析出与鉴定,2、DNA的鉴定,鉴定DNA时在试管中先加入物质的量的浓度为0.015mol/L 的NaCl溶液5ml于两只试管中，其中一只加入DNA丝状物，各加入二苯胺4ml 试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min,待试管冷却后，比较两只试管中溶液颜色的变化，看看溶解有DNA的溶液是否有蓝色,（四）DNA的析出与鉴定,讨论：,答：有丝状物的试管变成蓝色，另一试管还是原来颜色,（2）这一鉴定结果说明
7、什么问题？,（1）比较两个试管中溶液的颜色有什么不同？,答：提取出的丝状物是DNA,（3）DNA的直径约为2010-10 m，实验中出现的丝状物的粗细是否表示1个DNA分子直径的大小？,答：DNA分子直径只有2 nm。丝状物是多个DNA子聚在一起形成的,（四）DNA的析出与鉴定,讨论：加入蒸馏水的目的？,降低NaCl溶液浓度到使DNA溶解度最低点，使DNA从NaCl溶液中析出,（四）DNA的析出与鉴定,小结：实验流程制备鸡血细胞液(加柠檬酸钠，静置或离心)破碎细胞，释放DNA(加蒸馏水，沿同一方向快速搅拌)过滤，除去细胞壁、细胞膜等溶解核内DNA(加入NaCl至2 mol/L，同一方向缓慢搅拌)DNA析出(加蒸馏水至NaCl浓度为0.14 mol/L，过滤，再溶解到2 mol/L的NaCl溶液中)除去细胞质中的大部分物质DNA初步纯化(与等体积95%冷却酒精混合，析出白色丝状物)除去核蛋白、RNA、多糖等DNA鉴定(二苯胺，沸水浴，呈现蓝色),
