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1、第六章 蛋白质翻译后修饰的鉴定,蛋白质翻译后修饰,蛋白质翻译后修饰在生命体中具有十分重要的作用，它使蛋白质的结构更为复杂，功能更为完善，调节更为精细，作用更为专一N-端fMet或Met的切除二硫键的形成化学修饰剪切,泛素化对于细胞分化与凋亡、DNA修复、免疫应答和应激反应等生理过程起着重要作用磷酸化涉及细胞信号转导、神经活动、肌肉收缩以及细胞的增殖、发育和分化等生理病理过程糖基化在许多生物过程中如免疫保护、病毒的复制、细胞生长、炎症的产生等起着重要的作用脂基化对于生物体内的信号转导过程起着非常关键的作用组蛋白上的甲基化和乙酰化与转录调节有关,第一节 蛋白质翻译后修饰的鉴定,一、生物体内的蛋白质
2、磷酸化修饰及其功能蛋白质的磷酸化反应是指通过酶促反应把磷酸基团从一个化合物转移到另一个化合物上的过程,是生物体内存在的一种普遍的调节方式，在细胞信号的传递过程中占有极其重要的地位蛋白质激酶催化的把ATP或GTP上位的磷酸基转移到底物蛋白质氨基酸残基上的过程,蛋白质磷酸化在细胞信号转导中的作用 在胞内介导胞外信号时具有专一应答特点胞内信使，cAMP，Ca2+，DG（二酰甘油）蛋白质的磷酸化与脱磷酸化控制了细胞内已有的酶“活性”对外界信号具有级联放大作用 蛋白质的磷酸化与脱磷酸化保证了细胞对外界信号的持续反应,磷酸化类型丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的磷酸酯化精氨酸、组氨酸和赖氨酸的亚酰胺化，天冬氨酸和谷
3、氨酸的酰化丝氨酸磷酸化：苏氨酸磷酸化：酪氨酸磷酸化=1800：200：1,被磷酸化修饰的蛋白改变所带的电荷改变催化基团的性质改变蛋白质的构象改变蛋白质的亚细胞分步蛋白质功能变化的多样性,蛋白质磷酸化研究有三个主要目的(1)对位于某一特定状态下细胞内的给定蛋白质在体内的磷酸化氨基酸残基定位(2)鉴定与磷酸化过程有关的激酶(3)分析所观察到的磷酸化现象对功能的影响,二、磷酸化蛋白质分析的概述,磷酸化修饰蛋白质的识别与检测是影响磷酸化蛋白质组学研究的关键技术之一细胞内仅有少部分蛋白质被磷酸化,即使蛋白质的表达量处于相对较高的水平,该蛋白质的磷酸化部分的分析也很困难,一般一个发生磷酸化的蛋白质其磷酸化
4、的部分仅占其总量的10%磷酸化蛋白质含量少，化学计量值低，磷酸化的肽段很容易淹没在大量非磷酸化的肽段中,二、磷酸化蛋白质分析的概述,体外 pmol,体内 fmol,32p蛋白标记,32p细胞标记,蛋白质分离,蛋白酶切,蛋白酶切,2DPP作图,2DPP作图,LCESI-MS或MALDI-MS,LCESI-MS,HPLC,IMAC,磷酸氨基酸分析,相关分析,二、磷酸化蛋白质分析的概述,双相磷酸多肽谱图 2DPP多肽在薄层纤维板上进行电泳是第一相，在同一块板上进行薄层色谱(TCL)为第二相，分离得到的磷酸肽用放射自显影或磷储屏检测此方法提供了其他方法不能提供的有关蛋白质磷酸化状态的重要信息(1)磷酸
5、化位点的最大数目(2)放射自显影强度提供了在所有磷酸化肽中磷酸化的相对化学计量(3)电泳和TCL的正交分离提供了磷酸肽之间亲水性的相对状态,二、磷酸化蛋白质分析的概述,磷酸肽本身所具有的负电性使其在正离子模式的质谱分析中信号受到抑制，在MALDI源的质谱仪中磷酸肽的信号丰度会比其相应未磷酸化肽段的信号强度要低很多磷酰键较肽键容易断裂，使磷酸化蛋白比非磷酸化蛋白鉴定要困难的多,三、磷酸化蛋白质的检测,32P放射性标记法抗体免疫印迹检测法,1、32P放射性标记法,32 P 放射性标记法是最经典的磷酸化蛋白质检测方法放射性32P标记的ATP处理细胞，使32P掺入磷酸化蛋白质培养待标记的细胞至适当的生
6、长期，在生长旺盛的细胞中磷酸盐的转运达到最高峰，用不含磷酸盐的标记培养液替换原来的细胞培养液，并加入32P标记磷酸盐共培养，使细胞ATP库与32P平衡，蛋白激酶利用被放射标记的ATP使底物磷酸化,局限性磷酸转换速率较低的磷酸化蛋白质不能标记组织样本放射性污染,2、抗体免疫印迹检测法,通过抗磷酸氨基酸抗体与磷酸化蛋白质的免疫印迹反应(Western blotting)来检出磷酸化蛋白质是较常用的方法在真核细胞中最常见的磷酸化修饰是在蛋白质的丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基侧链羟基磷酸化已经有商品化的抗酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸磷酸盐抗体,其中抗酪氨酸磷酸盐抗体的特异性最好，磷酸化丝氨酸和苏氨酸的抗原决定簇
7、较小,抗原抗体结合位点有空间障碍,所以抗体的结合力较差免疫印迹法与免疫沉淀相结合,可以在电泳之前先富集目的蛋白质,但这样也有可能丢失部分低丰度的目的蛋白质,同时免疫沉淀技术对抗体的要求更高,抗磷酸酪氨酸抗体具有较好的亲和性可以进行免疫沉淀实验,样品制备（细胞、组织、体液提取蛋白质）,制备型2D胶电泳,分析型2D胶电泳,考马斯亮蓝染色,转印到膜,找出相应的磷酸化蛋白质,磷酸氨基酸抗体免疫检测得到磷酸化蛋白质,染色得到全部蛋白质点,磷酸化蛋白质鉴定,图谱比较,四、蛋白质磷酸化位点的分析,1、磷酸肽的分离和富集分离浓缩分析物，提高信噪比如果磷酸肽被放射性标记，并具有相同的比活度，那么每一个被分离的肽
8、段相应的活度计数就表明这一组分中磷酸肽的相对量，如果已知所用放射性标记物的比活，就能容易算出磷酸肽的绝对量放射性标记的磷酸肽的分离谱可以用来定量检测不同时间或细胞状态下蛋白质磷酸肽状态的变化肽分离方法也有效地除去了非肽类杂质，更有利检测和分析低丰度磷酸肽,1、磷酸肽的分离和富集,方法反相液相色谱（PR-HPLC）免疫沉淀固相金属亲和色谱金属氧化物/氢氧化物亲和色谱离子交换和等电聚焦,免疫沉淀,原理,当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质蛋白质间的相互作用被保留了下来如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来,免疫沉淀物,固相金属亲和色谱Immob
9、ilized metal affinity chromatography,IMACIMAC柱：金属离子、螯合剂、填料原理：带正电的金属离子，如Fe3+、Ca3+、Cu2+可以与带负电的磷酸集团产生静电交互作用而结合，这种结合能力受pH值、离子强度和溶液有机相的影响，在高pH或磷酸盐存在的缓冲液中，金属离子与磷酸基团间的结合被破环，磷酸肽被释放出来,局限性丢失低丰度、没有结合到IMAC柱上的磷酸化肽段具有多磷酸化位点的肽由于较强的亲和力较难被洗脱下来酸性基团（天冬氨酸、谷氨酸）、电子供体（组氨酸）也会结合到柱上，造成非磷酸化肽的污染效果：依赖于所选择的金属离子、填充柱的材料及洗脱程序,金属氧化物
10、/氢氧化物亲和色谱Metal oxide/hydroxide affinity chromatography,MOACTiO2、Al(OH)3、ZrO2TiO2富集磷酸肽原理：TiO2是一种两性物质，由于钛原子和氧原子的原子表面化合价不饱和，TiO2在不同的pH值下可以表现为路易斯酸或路易斯碱在酸性溶液中，钛原子带正电表现为路易斯酸，可以与阴离子结合。磷酸盐、硼酸盐、硫酸盐都与TiO2具有高度的亲和力，其中TiO2与磷酸盐的结合能力最高调节pH值后，TiO2可用于富集磷酸肽,离子交换和等电聚焦离子交换（strong aion exchange,SAX/strong caion exchange
11、,SCX）:离子强度不同进行分离IEF:等电点不同进行分离主要用于复杂样本的预分离，降低样本复杂程度结合金属亲和等其他富集技术，可取得很好的效果,2、磷酸肽的识别,质谱技术质谱技术结合磷酸酶水解,MALDI-TOF MS 可以通过肽指纹谱(PMF)鉴定蛋白质，与磷酸酯酶处理相结合可以确定磷酸化位点原理：磷酸酯酶处理后，磷酸化的肽丢失磷酸基团而产生特定质量数的变化，MALDI-TOF MS通过检测这种质量数的变化而确定磷酸化位点,原理,通过MALDI-TOF/TOF一级质谱可发现与肽段分子量理论值相差80Da(HPO3=80Da)的质谱峰,该峰的二级质谱图中如果母离子与旁边的最高强度的质谱峰相差
12、98Da(中性丢失H3PO4=98Da),则可确定该肽段为磷酸化肽段,进一步通过二级或多级质谱的谱图确认具体的磷酸化位点利用消除反应使丝氨酸、苏氨酸磷酸化残基转化为氨乙基丙氨酸,后者为赖氨酸的同形物,此位点可被胰蛋白酶和Lys-C肽链内切酶等酶特异性识别、酶切,通过质谱即可很容易地判断磷酸化位点。,消除反应是从反应物的相邻碳原子上消除两个原子或基团，形成一个键的过程 1,2 消除反应（-消除反应）,PSD-MALDI-MS分析,源后衰变发生在源内离子化之后的分子裂解MALDI-TOF-MS离子源内发生的离子在真空无电场飞行管飞行过程中发生结构裂解，丢失一个中性分子后产生了碎片离子碎片离子具有与
13、其前体离子相同的飞行速度，但由于质量小，动能比前体离子小（亚稳离子）消除反应丢失HPO3或H3PO4，产生数减少80Da或98Da亚稳离子,图 利用MALDI-TOF/TOF谱图鉴定磷酸化肽段a:酶切产物的一级质谱图。磷酸化肽段的质谱峰用星号标出,其相对未磷酸化肽段的理论分子量位移80 Da(HPO3=80 Da);b:a中标记星号的质谱峰的二级质谱分析。在图中可见比母离子小98 Da(H3PO4=98 Da)的中性缺失峰,串联质谱(MS/MS)前体离子扫描通过检测磷酸基团产生的特定片段来报告磷酸肽的存在；磷酸化肽经CID（碰撞诱导解离）后会产生磷酸基团的特异性片段，这些特异性的片段在用串联质
14、谱进行前体离子扫描时可作为磷酸肽的“报告离子”,前体离子扫描,在三级四级串联质谱采用使各种质荷比的离子依次通过Q1分析器，Q2为碰撞诱导解离室，将Q3分析器的电压和频率设定为只能传输某一特定质荷比，即特定质荷比的子离子直接检测在碰撞诱导解离过程中丢失的碎片离子,前体离子扫描,分析磷酸肽负离子模式设定Q3中仅能通过的子离子质荷比m/z 79，即磷酸肽丢失的PO3-，这样得到的质谱图仅显示丢失m/z 79的离子的谱峰 丢失磷酸根离子的磷酸肽谱峰多肽产生的各种碎片离子中，质量数在79Da附近的几乎没有,中性丢失扫描,具有两级质量分析器和碰撞诱导解离室的串联质谱仪Q1和Q2同步扫描，但扫描范围不一样，
15、保持一个特定的电压差值，这个电压差所代表的质荷比m/z值代表一个中性分子的质量将Q1输送来的离子碰撞诱导裂解，再将碎片离子送入Q3只有在Q2中诱导裂解后能丢失这一特定中性分子的离子才会被Q3传输到检测器,中性丢失扫描,分析磷酸肽从带一个正电荷的M+H+肽混合物中寻找丢失中性磷酸分子H3PO4的磷酸肽，则Q1和Q3的扫描电压差所代表的质荷比应为m/z 98从带两个正电荷的M+2H2+肽混合物中寻找丢失中性磷酸分子H3PO4的磷酸肽，则Q1和Q3的扫描电压差所代表的质荷比应为m/z 49只能分析磷酸化丝氨酸和磷酸化苏氨酸,3、磷酸化氨基酸位点的确定,用于确定磷酸化肽中磷酸化位点的质谱方法基于两种不
16、同原理第一种方法取决于磷酸酯键的化学稳定性如在ESI质谱仪的碰撞室或离子源中，或在MALDIMS的源后裂解（PSD）过程中磷酸化肽可通过磷酸酯键断裂产生的碎片离子鉴定,第二种方法基于肽段增加的磷酸酯基团的质量数如果蛋白是已知的，可通过质量数来确定肽段在某些情况下，肽段只含有一个丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基，则很容易找到磷酸化位点，但在大多数情况下肽段含有许多个丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基，则确定磷酸化位点发生困难,五、蛋白质磷酸化的定量分析,定量：磷酸化蛋白与其对应的非磷酸化蛋白质的比例研究的蛋白样本酶切后等分成两部分,一部分直接用CH3OH甲酯化,另一部分经过磷酸酯酶处理后用CD3OH甲酯化,随
17、后将两者混合进行串联质谱研究,即可得到磷酸化肽段的磷酸化水平的定量信息该技术设计巧妙,但甲酯化的效率可能会影响定量结果,一种基于稳定同位素标记的分析技术SILAC(stable isotope labeling with amino acids in cell culture)采用含有轻同位素型和重同位素型氨基酸的培养液对不同细胞分别进行培养,使细胞内的蛋白被同位素稳定标记,提取细胞蛋白并将其等量混合,酶切后进行质谱鉴定,通过分析不同标记型肽段的相对量而确定蛋白的相对量15N稳定同位素标记法、磷酸肽同位素亲和标记法既可以研究全蛋白质组的变化,也可以结合磷酸化肽段的富集技术和串联质谱技术对磷酸化
18、肽段进行定量研究,15N稳定同位素标记法,一种正常培养基，一种由15N提供N源质谱图中，每一个水解肽段表现为一对峰15N/14N的同位素丰度比可以体现出两种细胞来源蛋白质表达量的相对水平两种细胞表达完全一致，所有15N/14N丰度比将在一个平均值范围内两种来源的蛋白质的磷酸化程度不同，其含磷肽段与相应未磷酸化肽段的15N/14N的丰度比就与平均值不同，根据其比值来进行磷酸化程度的相对定量,15N稳定同位素标记法,磷酸肽同位素亲和标记法,使磷酸肽或磷酸化蛋白在碱性环境下发生消除，同时用亲核试剂攻击形成的双键并发生加成反应对不同来源的磷酸肽或磷酸化蛋白使用不同的亲核试剂其中一种试剂上的氢由氘代替再
19、通过化学反应在加成的亲核试剂上连接一个亲和标签（生物素）,磷酸肽同位素亲和标记法,磷酸肽同位素亲和标记法,磷酸肽同位素亲和标记法,磷酸肽同位素亲和标记法,第二节 糖基化蛋白质的鉴定,糖蛋白是由短的寡糖链与蛋白质共价相连构成的分子 糖蛋白包括酶、激素、载体、凝集素、抗体等 糖蛋白携带某些蛋白质代谢去向的信息 寡糖链在细胞识别、信号传递中起关键作用,一、糖蛋白的结构特征,糖链与蛋白的连接方式 N-糖苷键型：寡糖链（N-乙酰氨基葡萄糖GlcNAC的-羟基）与Asn的酰胺基、N-未端的-氨基、Lys或Arg的-氨基相连 O-糖苷键型：寡糖链（GalNAC的-羟基）与Ser、Thr和羟基赖氨酸、羟脯氨酸
20、的羟基相连 S-糖苷键型：以半胱氨酸为连接点的糖肽键 酯糖苷键型：以天冬氨酸、谷氨酸的游离羧基为连接点,糖蛋白中糖链的结构糖蛋白中的糖链变化较大，含有丰富的结构信息，寡糖链往往是受体、酶类的识别位点N-糖苷键型（N-连接）高甘露糖型：由GlcNAc和甘露糖组成 复合型：除了GlcNAc和甘露糖外、还有果糖、半乳糖、唾液酸；杂合型：包含和的特征，五糖核心O-糖苷键型（O-连接）没有五糖核心,分类可溶性糖蛋白存在于细胞内液、各种体液及腔道腺体分泌的粘液中血浆蛋白除白蛋白外皆为糖蛋白。包括酶（如核酸酶类、蛋白酶类、糖苷酶类）、肽类激素（如绒毛膜促性腺激素、促黄体激素、促甲状腺素、促红细胞生成素）、抗
21、体、补体、以及某些生长因子、干扰素、抑素、凝集素及毒素等,膜结合糖蛋白肽链由疏水肽段及亲水肽段组成，疏水肽段可为一至数个，并通过疏水相互作用嵌入膜脂双层中；亲水肽段暴露于膜外糖链连接在亲水肽段并有严格的方向性：在质膜表面糖链一律朝外，在细胞内膜一般朝腔面包括酶、受体、凝集素及运载蛋白等，常参与细胞识别，并可作为特定细胞或细胞在特定阶段的表面标志或表面抗原,凝集素糖结合蛋白，能专一识别某一特定的单糖或寡糖中特定的糖基序列而与之结合富集、浓缩、分离、糖链的结构分析,结构糖蛋白为细胞外基质中的不溶性大分子糖蛋白胶原及各种非胶原糖蛋白(纤粘连蛋白、层粘连蛋白等)作为细胞外基质的结构成分起支持、连接及缓
22、冲作用，参与细胞的识别、粘着及迁移，并调控细胞的增殖及分化,二、生物质谱技术鉴定糖蛋白,糖蛋白,糖苷内切酶,还原、烷基化、蛋白酶解,MALDI-TO-MS,糖含量,相对分子量,MALDI-TO-MS,ESI串联质谱,凝集素提取,氨基酸序列,糖基化位点,糖肽片段,糖含量、糖苷键类型、糖基化位点是糖蛋白一级结构的重要指标糖蛋白的平均分子量及糖含量的测定糖苷内切酶将糖链切掉，将反应前后的质谱图比较，就能直接表述糖链的平均质量，而糖蛋白的平均糖含量可由糖链的平均质量占糖蛋白平均相对分子质量的百分比来表示,糖基化类型及糖基化位点的确定蛋白酶酶切和糖苷内切酶相结合先用蛋白酶将糖蛋白酶切成含有或不含有糖链的
23、肽片段，获得糖蛋白的肽质量指纹谱，再用糖苷内切酶将糖链切除，其肽质量指纹谱将发生变化，原含有糖肽段的质量由于糖链的丢失在质谱图发生位移，通过网上数据库检索可以得到位移肽段的氨基酸序列，从而确定糖基化位点,1、MALDI-TOF-MS的应用,基质的选择-腈基4羟基肉桂酸,1、MALDI-TOF-MS的应用,糖蛋白的平均分子质量及糖含量的测定糖蛋白分子结构具有不均一性糖链的微不均一性糖基化位点的不均一性多羟基结构的糖链使其质子化能力低糖链末端唾液酸的干扰,1、MALDI-TOF-MS的应用,糖蛋白的平均分子质量及糖含量的测定糖链的微不均一性质谱图上表现一簇峰G各峰之间约相差一个糖基有时还出现双电荷
24、峰G2分子离子峰变宽，糖链分子质量越大，峰越宽，灵敏度越差,1、MALDI-TOF-MS的应用,典型的糖蛋白的出峰模式，不均一性造成多种糖形存在,为51000的双电荷峰,杂质,N-糖基化质谱分析图,1、MALDI-TOF-MS的应用,去糖基化处理的质谱分析图,去糖基化的单电荷峰，图谱变得简单且峰形尖锐,去糖基化的双电荷峰,完整的未发生去糖基化的单电荷峰,1、MALDI-TOF-MS的应用,经唾液酸酶去唾液酸化处理的质谱分析,去唾液酸化的单电荷峰,去唾液酸化的双电荷峰,1、MALDI-TOF-MS的应用,糖基化类型及糖基化位点的确定寻找质谱图上峰的位移从位移峰的肽段序列中，寻找出可能连接糖链的氨
25、基酸,2、LC-ESI-Q-TOF-MS,糖链结构的分析串联质谱的母离子扫描技术选择特定的糖链离子，经碰撞活化使用惰性气体将其打碎，从而推断糖链结构如人血清转铁蛋白的糖链结构分析选择以HPLC分离的一个糖链，其分子离子双电荷M+2H2在电喷雾串联质谱中为823.8，将其设为母离子，以惰性气体与其碰撞产生碎片,2、LC-ESI-Q-TOF-MS,糖链结构的分析,2、LC-ESI-Q-TOF-MS,糖链结构的分析中性丢失,3、凝集素在糖蛋白分析中的应用,伴刀豆蛋白（ConA）对高甘露糖型N-糖链有专一性麦胚凝集素（WGA）对杂合型N-糖链有专一性兵豆凝集素对亲和核心岩藻糖类糖链有专一性,糖蛋白结构
26、质谱解析,母离子,糖蛋白结构质谱解析,由于N-糖蛋白壳二糖核心中与天冬酰胺连接的乙酰葡萄糖胺残基会在碰撞过程中发生跨环断裂，先后产生质荷比相差120，80的中性碎片丢失，这两个碎片是发现糖基化位点及糖肽氨基酸序列的标志,糖蛋白结构质谱解析,3、凝集素在糖蛋白分析中的应用,第三节 蛋白质相互作用的鉴定,免疫沉淀酵母双杂交系统噬菌体展示技术串联亲和纯化(tandem affinity purification，TAP)蛋白质片段互补分析（protein fragment complementation analysis,PCA）蛋白质芯片,酵母双杂交（two hybrid system）研究真核基
27、因转录调控时建立利用真核生长转录因子的两个不同的结构域：DNA结合结构域(DNAbinding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)，分别与目标蛋白X 及可能与目标蛋白相互作用的蛋白Y 相连，并共同转入酵母细胞;如果蛋白X与Y能够发生相互作用就能使转录因子原来分开的两部分结合，形成完整的活性形式从而激活下游报告基因;通过检测报告基因的表达产物就可判断两种蛋白是否发生相互作用,酵母激活因子 GAL4：N端：147个氨基酸组成的DNA结合域(DNA binding domain,BD)，C端：113个氨基酸组成的转录激活域(transcr
28、iption activation domain,AD)GAL4分子的DNA结合域可以和上游激活序列(upstream activating sequence，UAS)结合，而转录激活域则能激活UAS下游的基因进行转录组成部分：（1）与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白（bait）（2）与AD融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称靶蛋白（prey）（3）带由一个或多个报告基因的宿主菌株,酵母双杂交系统,Yeast Two Hybrid原理,BD,X,COOH,AD,cDNA,NH2,COOH,共转化,+,BD,X,?,AD,Gal4,Gal4,Promoter,Reporter,Tr
29、p-,Leu-,cDNA library,NH2,Gal4,Gal4,优点,作用信号是在融合基因表达后，在细胞内重建转录因子的作用而给出的，省去了纯化蛋白质的繁琐步骤检测在活细胞内进行，可以在一定程度上代表细胞内的真实情况 检测的结果可以是基因表达产物的积累效应，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库，能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白 以用作大规模的蛋白筛选，在较短时间内对找到某些药物对相关组织主要的作用蛋白，对于药物的修饰和改进明确方向,局限性,(1)不能研究具有自激活特性的蛋白质；(2)
30、只能检测两个蛋白间的相互作用；(3)检测的相互作用需发生在细胞核内，对于不能定位到细胞核中的蛋白质无法研究；(4)大部分实验中有将近50%的假阳性率，且推测的相互作用仅有3%在两种以上的实验中得到验证,噬菌体展示技术,噬菌体表面展示技术是一种对多肽功能非常有效的筛选技术，即将外源蛋白分子或多肽的基因克隆到丝状噬菌体基因组中，与噬菌体外膜蛋白融合表达，展示在噬菌体颗粒的表面由于外源蛋白或多肽的基因型和表型统一在同一噬菌体颗粒内，因此，通过表型筛选就可以获得它的编码基因,PIII,融合蛋白,PIII,基因型,表达型,外源基因融合于噬菌体不同区段外壳蛋白基因的表达模式,Solid phase sel
31、ection with immunotubes,Immunotubecoated withantigen,coated withsteptavidin and biotinylated antigen,B,biotin,antigen,Solution phase selection with biotinylated antigen,Bind to Streptavidin,coated microtitre wells,去除未结合的噬菌体病毒粒子,洗脱结合的噬菌体,Amplify eluted phageRepeat selectionAnalyzea)ELISAb)Specificity
32、c)Sequencingd)Affinitye)Activity,E.coli,感染和扩增,经典噬菌体展示技术筛选流程图,串联亲和纯化(tandem affinity purification，TAP),融合标签方法：两个连续的标签标签共分三部分：蛋白A C B P(calmodulin binding peptide，钙调素结合多肽)中间连接的TEV 酶识别的酶切位点,带有TAP 标签的融合蛋白在细胞中表达与内源相互作用蛋白形成复合物，细胞裂解后经IgG 偶联的层析柱纯化，蛋白A 与IgG 特异结合，从而使含有标签的复合物得到第一次纯化；为了除去与柱填料非特异结合的蛋白，用TEV 酶切割分离
33、蛋白A 标签，使含有靶蛋白的复合物与层析柱分离并经过钙调素偶联的亲和层析柱进行第二次纯化，靶蛋白上的CBP标签可与钙调素结合；在加入过量螯合剂EGTA后CBP 与亲和层析柱分离使含有靶蛋白的复合体得到分离纯化，经SDS-PAGE，复合物中的各个蛋白被分开，切胶、胰酶消化后，即可通过质谱鉴定复合物中各个蛋白的氨基酸序列,优点,(1)不需要过多的背景知识就可以得到大量含靶蛋白的复合体；(2)蛋白表达及与复合物的结合都接近生理水平，是一种检测体内蛋白相互作用的方法；(3)TAP 采用两步亲和纯化，提高了纯化产物的特异性：一般在2L 的酵母培养基中(细胞湿重约10g)可以分离纯化得到足够一维电泳及质谱
34、分析的蛋白复合物,蛋白质片段互补分析（protein fragment complementation analysis,PCA）,泛素蛋白可以分为两个片段将编码这两个片段的基因分别分别与编码“诱饵”蛋白和“猎物”蛋白的基因在胞质内进行进行融合表达，如果“诱饵”蛋白和“猎物”蛋白发生相互作用，则泛素蛋白的两个片段得到重组而形成完整的泛素蛋白在泛素蛋白的介导下，作为泛素蛋白介导酶底物的报告蛋白被酶解，通过检测报告蛋白的含量变化监测蛋白质间的相互作用,已成功用于膜蛋白相互作用的系统化研究将荧光蛋白等报告蛋白作为蛋白互补片段与“诱饵”蛋白和“猎物”蛋白融合表达，可直接监测荧光蛋白特性的改变鉴定蛋白质的相互作用更为直接，减少假阳性反应（环境因素、激素介导的蛋白质相互作用），能检测任何细胞类型的体内和体外的蛋白质相互作用融合蛋白的设计和表达要求较高,
