蛋白鉴定分析.ppt

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1、蛋白鉴定分析,蛋白质性质鉴定 1 蛋白质分子量测定 DSD-聚丙烯酰胺凝胶电泳 凝胶排阻层析 电喷质谱 核磁共振 2 蛋白质等电点的测定 聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳 PBE-Sepharose聚焦层析,1概述1.1什么是蛋白质性质鉴定蛋白质分析鉴定是蛋白质研究中的一个最基本技术,是确定蛋白质产品的是与非的问题,尤其是在研究新的蛋白质组分时显得更重要。研究一个新的蛋白质首先要从它的基本性质作为突破口，然后根据它的基本性质进行分离纯化，最终用纯品对其进行分析鉴定。如果对蛋白质的基本性质尚未搞清楚，工作起来将会困难重重。因此，蛋白质研究技术主要是对蛋白质的基本性质的进行分析鉴定。,1.2蛋白质鉴定的

2、主要参数蛋白质分子是非常复杂的生物大分子,能代表其特征参数很多.但在普通实验室能够进行测定的、最常用的参数，归纳起来主要有以下几种。(1)蛋白质的质量鉴定(分子量)(2)蛋白质带电性鉴定（等电点）(3)蛋白质结构鉴定(一、二级结构、晶体结构、肽谱、N和C-末端)(4)蛋白质生物学功能鉴定(生物活性、比活、酶促动力学)(5)免疫学鉴定（抗原-抗体反应、酶联免疫反应）,2蛋白质鉴定方法 蛋白质可鉴定的参数很多，这里主要介绍蛋白质的分子量和等电点两个主要参数。2.1蛋白质分子量测定 早期测定蛋白质分子量的方法是采用超速离心和光散射等方法。由于这些方法需要高级的精密仪器设备和大量的蛋白样品才能进行测定

3、，所以目前采用的不多了。自从葡聚糖凝胶层析介质(Sephadex G系列产品)及排阻层析技术问世以来，就被广泛应用于蛋白质的分子量测定。它是目前实验室测定白质分子量常用技术之一。但是这种层析介质刚性较差，在层析过程流速较慢，分离时间长。近年来又研究出刚性的耐压的凝胶层析介质，被用于高效液相色谱。大大的提高了工作效率和测定精度。,随着聚丙烯酰胺凝胶电泳的出现和发展，DSD-PAGE电泳成了常用的方法。从90年代初期随着毛细管电泳的出现，应用毛细管电泳无胶筛分技术来测定蛋白质分子量，是一种较好的选择。蛋白质氨基酸测序技术，质谱技术和核磁共振波谱技术的发展，给蛋白质分子量测定技术增添了新的途径。尤其

4、是采用电噴质谱测定蛋白质分子量，既快捷有准确。该技术在生物领域应用越来越广，是一种快速精确的好方法。蛋白质的分子量测定技术归纳起来大致分三大类电泳技术，层析技术，光谱分析技术。,2.1.1 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定法 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，也称为十二烷基酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)。主要用于蛋白质亚基分子量的测定。它具有操作简单，重复性好，对样品的纯度要求不高等特点，是目前使用较为广泛的测定蛋白质亚基分子量的一种方法。,(1)原理：a.蛋白质分子状态

5、在自然状态下蛋白质通过二硫键聚合形成高度折叠的生物大分子，在水溶液中，由于氨基酸残基的解离作用使蛋白质分子形成带有一定净电荷的分子。在电场下向自身电荷相反的方向移动。,b.还原剂的解聚作用 在蛋白溶液和分离凝胶介质中加入还原剂-巯基乙醇(-mercaptoethanol)或二硫苏糖醇(Dithiothretiol,DTT)。蛋白质分子在还原剂作用下二硫键被还原，将多聚体或单链折叠的蛋白质分子的二硫键打开，形成长短不一的单链亚基。,c.SDS的包裹作用 SDS分子中含有大量的带负电的磺酸基。蛋白质分子解聚后形成的氨基酸侧链与SDS结合，在SDS的重量达到蛋白重量的3-4倍时蛋白质分子表面完全被S

6、DS包裹，形成带负电荷的蛋白质亚基分子，称之为蛋白质-SDS复合物(protein-SDS micelles)。由于蛋白质-SDS复合物所带负电荷远大于蛋白质分子自身有的净电荷，这样就消除了不同分子之间原有的电荷差异。蛋白质-SDS复合物在水溶液中的形状象一个长椭圆棒。这种棒状物的长短与亚基的分子量大小成正比。在电场下，蛋白质-SDS复合物就会向正极移动，移动的速度与蛋白质本身带是什麽样的电荷和带多少电荷无关，只与椭圆棒状的长短有关，也就是与亚基的分子量的大小有关，利用这一性质可以测定蛋白质的分子量。,d.聚丙烯酰胺凝胶分子筛作用 不同浓度的凝胶和交联度，形成不同大小的网状结构，它对蛋白质-S

7、DS复合物具有阻滞作用。在电场下，分子量大的亚基受阻大，电泳速度慢，走在小分子的后面；分子量小的亚基受阻小，电泳速度快，走在大分子的前面。不同分子量的亚基受阻程度不同，表现出不同的电泳速度，这样就把同一样品中不同大小分子量的亚基分开。,(2)操作过程制胶 加样 电泳 固定 染色 脱色 计算,(3)结果处理a.电泳图谱,1 2 3,b.标准曲线绘制标准曲线：以标准蛋白质分子量的对数log(M)为纵坐标，Rf值为横坐标，绘制标准曲线。,c.未知蛋白分子量计算：将未知蛋白的mR值查到log(M)值，便可知其分子量。计算分子量方法除了用标准曲线法外,还可以用比较法和机读法.比较法:通常标准蛋白的相对位

8、置与未知蛋白的位置进行比较，初步判断。这是在发表论文时常用的表示方法。机读法：用凝胶扫描仪,将凝胶图谱扫描输入计算机中，通过影像文件系统处理，便很快得知未知样品的分子量。但发表论文时,仍然要注重原始图谱，经计算机处理的图谱有作假之嫌。,(4)影响因素 影响SDS-复合物形成的主要因素。SDS-电泳成败关之一，是在制备样品的过程中，蛋白质与SDS结合的程度直接影响电泳分离效果。影响结合的因素主要有三个:A、溶液中SDS单体的浓度 SDS在水溶液中以单体和SDS复合物混合存在的，能与蛋白质结合的只能是单体。单体的浓度与SDS总浓度，温度和离子强度有关。在一定温度和离子强度下，SDS处于一饱和值，即

9、单体浓度不再随SDS中浓度增加而增加。为了使SDS与蛋白质结合充分，SDS和蛋白质结合的重量比一般是4:1或3:1。,B、样品缓冲液离子强度 因为SDS结合到蛋白质分子上的量取决于平衡时SDS单体浓度，而不是总浓度，只有在较低的离子强度溶液中，SDS单体才具有较高的平衡浓度，所以样品缓冲液应选用低离子强度，通常是10-100mmol/l之间。C、二硫键是否完全打开 只有蛋白质分子中的二硫键完全被打开，蛋白质分子完全解聚，SDS充分与亚基分子结合，才能准确测定出亚基分子量。二硫键完全被打开要取决于巯基乙醇的质量和使用的剂量。若蛋白质分子的二硫键只是部分被打开，这是测出的分子量是蛋白质分子和亚基分

10、子的混合物。,凝胶排阻层析(1)原理：凝胶排阻色谱(Exclusion chromatography)，也称为分子筛层析、凝胶过滤层析。凝胶排阻色谱介质是以不同浓度的凝胶交联聚合而成的多孔径的，网状结构的球体。在色谱柱内不同大小凝胶的孔径可以通过不同大小的蛋白质分子。因此，凝胶排阻色谱介质对蛋白质分子具有排阻作用。在凝胶排阻色谱分离的分离过程中，大分子先流出，小分子后流出。,(2)蛋白质分子形状：蛋白质分子一般有两种形状，一种是球形分子，另一种是线性分子。在色谱过程中，大分子不能进入或不能完全进入凝胶内部孔径而沿凝胶颗粒之间的空隙向前移动，迁移距离短，最先流出柱外来。小分子可以进入凝胶内部孔径

11、慢慢向前移动，迁移距离长，最后流出柱外来。线性蛋白质分子与球形分子比较，同样大小分子量的蛋白质，线性分子体积大流速快，球形分子体积小流速慢。因此，在凝胶色谱柱中无论是球形分子还是线性分子都可进行分离，但是球形分子比线性分子的分离度好。,(3)凝胶层析介质 凝胶层析介质主要有五类Sephadex,Biogel,Sepharose,utrol gel,perfuson等。A、葡聚糖凝胶(Sephadex)葡聚糖凝胶是以葡聚糖为原料合成的珠状凝胶，其主要技术指标,后面的阿拉伯数字越大，表示交联越小，凝胶孔径越大，分子量分离范围越大。凝胶的溶胀体积。凝胶性能：耐高温100 沸水煮 pH范围pH211稳

12、定 在高盐浓度下体积易收缩B、聚丙烯酰胺凝胶(Boigel)Biogel是由丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺交联制成的球状凝胶色谱介质。根据溶胀性质可分Biogel、P2、P4 P300等10种。其主要技术指标是：,“P”后面的拉伯数字越大，表示吸水性越大，凝胶的交联度越小，分子量分离范围越大与 Sephadex相似。性能：刚性好流速快 在pH 2-11的溶液中稳定 高温下酰胺基易被水解产生羧酸 对酸、碱性较强的物质及芳香族化类合物均用不同程度的吸附。,琼脂糖凝胶Sepharose系列 琼脂糖凝胶是由琼脂糖经特殊工艺制成的珠状凝胶，琼脂糖中凝胶的结构是氢键而不是共价键，因此,物理稳定性较差。通常把琼脂

13、糖凝胶层析介质浸泡在水溶液中。其主要技术指标是：,阿拉伯数字后面的B表示琼脂糖凝胶的百分浓度，琼脂糖浓度越大表交联度越大，分子量分离范围越小。与此相反琼脂糖浓度越小表交联度越小，分子量分离范围越大。性能：耐温：交联琼脂糖凝胶可耐受100120 耐酸碱：在pH312范围内稳定 耐盐：在6M尿素中稳定,(4)方法介质溶胀 装柱 平衡 上样 洗脱 计算分子量 分离过程,5)结果处理a层析图谱,B、标准曲线 分子量的测定方法，一般都采用标准曲线法。使用几种不同分子量的混合标准蛋白，经排阻色谱进行分离会得到不同标留值的色谱峰，以分子量的对数值(lgMr)为纵坐标，以收集体积(ml)为横坐标，绘制标准曲线

14、图。然后将未知样的标流体积在准曲线先上查得分子量。,、,C、未知蛋白分子量计算 将未知蛋白排阻层析的洗脱体积从标准曲线上查到相应的log(M)值，便可求出其分子量。(6)应注意的问题：A、样品:前处理:样液要进行适当的前处理,如离心，沉淀，抽提等浓度:样液浓度不宜太稀组分:样液组分不宜太多，目标组分与相邻组分之间的分子量至少要相差2000以上。B、上样：对组别分离:上样体积不超过柱床体积的30左右对组分分离:上样体积不超过柱床体积的1-2左右,C、流速:流速是指在单位面积液体所流过的量，排阻色谱要选择较理想的流速才能得到好的结果，选择的原则是：根据介质颗粒大小选择根据上样体积根据样品中的组分多

15、少。,2.3质谱法2.3.1原理：质谱仪是利用电磁学的原理，使带电的样品离子按质荷比进行分离的装置。离子电离后经过加速进入磁场中。其动能与加速电压及电荷Z有关。Z：电荷数 ZeU=mv2/2 e：电荷(e=1.60 x10-19C)U：加速电压m：离子的质量v：离子被加速后的运动速度,具有速度v的带电离子进入质谱仪的电磁场中，根据所选择的分离方式，最终实现各种离子按m/z进行分离。根据质量分析器的工作原理，可将质谱仪分为动态和静态仪器两大类，静态仪器采用稳定的电磁场，按空间位置来区别m/z不同的离子。动态仪器采用变化的电磁场，按时间不同来区分m/z不同 的离子。分离生物大分子多采用电喷质谱法，

16、属于动态质谱仪。基本原理是生物大分子在很高的电场下电离。样品溶液以很低的流速，在高的電場下使生物分子从毛細管中流出來。,2.3.2方法：样品溶液以很低的流速(1-20l/分钟)从毛细管中流出来。在毛细管的柱头上施加一个高电压(1-5kv)，是柱头液体雾化成很细的带电液滴，这种带电液滴在逆向干燥气流中挥发，使液滴表面电荷密度增大。直到产生的库仑斥与液滴表面张力的雷利极限值相等时，液滴就会发生爆裂，形成更小的子液滴，这些子液滴又被蒸发，又会形成爆裂。如此循环下去，直到液滴变得非常小，它的表面的电荷密度变得非常大，形成很强的电场，并从液滴中解离出带多电荷的分子离子。这些离子是靠吸附上或丢失若干质子而

17、形成的，所以正离子或负离子谱上会观察到谱峰。生物大分子在ESI谱上往往是一组带不同的电荷的分子离子峰。,2.3.3结果,2.4核磁共振波谱 核磁共振波谱(nuclear magnetic resonance spectroscopy,NMR).是将具有磁矩的核放入磁场后，用适宜的频率的电磁波照射，它们就会吸收能量，发生原子核能级的跃迁，同时产生核磁共振信号，得到核磁共振波谱。在有机化合物中，经常用于1H和13C核的共振吸收波谱。在生物学方面主要研究生物大分子的结构和分子量。到目前为止，采用1H 2D-NMR（二维NMR）能解决的最大蛋白质分子量在10000Da左右。如果采用杂核多维NMR技术，

18、能解决的最大蛋白质分子量大在25000Da左右。,6几种测定蛋白质分子量方法的比较,3蛋白质的等电点测定技术3.1等电聚焦电泳(Isoelectrofocusing，简写IEF)原理 通常是指聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳。它是60年代初建立起来的一种蛋白质分离手段，现在已经成为单向蛋白质电泳分辨率最高的一种分离技术，其分辨率可以达到0.01个pH值，有的文献报道可以达到0.001个pH值。它是利用蛋白质分子或其它两性分子的等电点的差异进行电泳分离和分析。蛋白质在一个稳定的线性pH梯度的凝胶中电泳，蛋白质朝着与自身电荷相反的方向移动，在移动的过程中不断被凝胶中的反离子中和，最后静电荷完全被中和而停

19、止运动，聚焦在等电点的位置。,蛋白质与两性电解质(1)载体两性电解质：在等电聚焦电泳中，载体两性电解质具有以下两种功能：A 中和功能：两性电解质的性质在分离系统中形成一个平衡稳定的pH梯度，提供中和蛋白质电荷的离子，具有pH缓冲能。B 载电功能：两性电解质作为电的载体，具有运载“电流”的能力，有良好的导电性能,(2)蛋白质的等电点 蛋白质属于一种两性电解质。在不同的pH环境中所带的正负电荷不同。若在某特定的pH环境中其净电荷为零，此时的pH为该蛋白质的等电点，在电场下不泳动。载体两性电解质分类及pH范围 根据建立pH梯度的原理的不同，可以分为载体两性电解质pH梯度(Carrier Amphol

20、ytes pH Gradient)和固相pH梯度(Immobilized pH Gradient)。前者是在电场中通过两性缓冲离子建立pH梯度，后者将缓冲基团作为凝胶介质的一部分，分辨率比前者高一个数量级。,电极液根据不同的pH范围,选用不同的电极液,见下表,方法制胶 加样 电泳 固定 染色 脱色 计算3.1.6 pH值测定(1)标准曲线法：标准样品参照，绘制标准曲线(2)微电极法：微电极直接测定,3.2聚焦层析(chromatofocusing)原理(1)pH梯度的形成 一般的离子交换色谱中，pH梯度的产生，通常利用pH梯度混合器来制造连续的pH梯度。而聚焦色谱则是利用离子交换剂本身的带电基

21、团的缓冲作用形成梯度。当洗脱缓冲液通过聚焦离子交换介质时，就会自动形成pH梯度。在高pH缓冲液的平衡，使色谱柱内的介质均处于碱性条件，带有电负性的碱性基团，根据载体两性电解质的等电点不同，所带的电荷有差异而形成pH梯度。,(2)聚焦效应 当一种蛋白质在色谱柱内随洗脱液前移至接近其pI处时,此时的移动速度明显减慢。如果同样的组分第二次加样，起初它带负电荷,向正电荷(低pH)方向移动速度快，直至追上慢速移动的第一次加样的组分，而聚焦到一起，然后两次加样的同一组分一起前移，直至停留在pI处。3.2.2 聚焦介质 聚焦介质是以交联的琼脂糖凝胶为载体合成的,具有凝胶介质的基本特性，也有两性电解质的特性。

22、目前用的较多主要(1)PBE118偏碱性介质(2)PBE94偏中性介质,缓冲液(1)缓冲液分类a.起始缓冲液(start buffer)，如：乙醇胺-HClb.样品缓冲液(sample buffer),如：Tris-HAcc.洗脱缓冲液(eluting buffer),如：polybuffer 96-HCl(1)始缓冲液及洗脱缓冲液的配制方法,(2)洗脱缓冲液的配制方法 表二洗脱缓冲液的配制方法,方法聚焦层析柱 起始缓冲液 上样 多聚缓冲液 再生溶液结果,注意的问题：(1)样品中不能含有无机盐(2)根据蛋白质不同的等电点选择合适的聚焦介质和缓冲液。,3.3离子交换层析原理在一定情况下，离子交换

23、剂吸附物质的量和在溶液中游离的物质量达到平衡时，二者物质的质量之比称为分配系数（平衡常数），以 Kd表示：KdMs/MMs 单位重量的离子交换剂Ml 单位体积溶液中溶质的摩尔数设溶液中存在着A、B两种物质，当它们进行离子交换色谱时，原来吸附在离子交换剂上的离子被高浓度的A、B物质交换并被洗脱下来。由于A、B两种物质在同一溶液中的解离度不同，它们的电荷有差异，因此二者的迁移速度不同。由上样的起始点(原点)至A、B两组波峰的间距加大，最终形成两个波峰。,分离过程离子交换柱 平衡 上样 pH梯度洗脱 测定洗脱峰pH值影响因素(1)受离子交换剂非极性亲和力及两者空间关系的影响，尤其是分离的生物分子有一定的空间阻碍(2)受溶液pH值影响，pH值变化会影响溶质解离度的变化，从而影响溶质的交换量(3)受被分离物质中具有相反电荷离子影响,被分离物质与溶液中反离子静电引力形成的离子键,具有阻止样品与交换剂活性基团的交换作用.(4)盐离子的影响：盐离子浓度增加，盐离子与被分离物的亲和力增大，从而降低了被分离物质与离子交换剂的亲和力，导致已结合上去的物质被洗脱下来。,小结,