高效液相色谱法讲解.ppt

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1、高效液相色谱法HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY,中山大学公共卫生学院肖 琴,高效液相色谱法（high performance liquid chromatography,HPLC）又称高压液相色谱法,与经典液相色谱法相比较，HPLC优点：(1)高 效 分离效率高(2)高 速 流动相流动速度快、分析速度快(3)高灵敏度 10-910-11 g(4)高自动化 自动采集和处理数据，优化选择和 控制分离操作条件,第一节 概 述,缺点：(1)仪器复杂、价格昂贵(2)使用有机溶剂(费用较高，有害健康、污染环境),与GC相比较，HPLC的优点:应用范围广突出优点

2、不受样品挥发性和热稳定性的影响 流动相可选用不同极性的液体，参与对组分的分 配作用，分离效率(4)HPLC分离分析后的样品馏分易于收集,第二节 液相色谱法的分类,一、吸附柱色谱法(adsorption chromatography),二、分配柱色谱法(partition chromatography),三、离子交换色谱法(ion-exchange chromatography),四、尺寸排阻色谱法(size exclusion chromatography),一、吸附柱色谱法(adsorption chromatography),吸附柱色谱示意图,又称液固色谱,(1)分离原理,吸附色谱的实质就

3、是根据组分在吸附剂上吸附能力的不同来进行分离,吸附剂通常是多孔的固体颗粒物质，在它的表面存在分散的吸附活性位点,竞争吸附,Xm:在流动相中的组分分子 Xs:在吸附剂表面的组分分子Ms:在吸附剂表面的流动相分子 Mm:在流动相中的流动相分子 n:组分分子被吸附而从吸附剂表面顶替出来的溶剂分子数,吸附柱色谱分离原理,吸附剂表面被吸附保留的极性组分分子X,吸附剂表面的非极性流动相分子M,固体吸附剂,表面吸附活性位点,Ka 的大小取决于组分分子和吸附剂之间以及组分分子和流动相之间作用力的强弱 Ka 值大，表示组分在吸附剂上保留强，难以洗脱Ka 值小，表示组分在吸附剂上保留弱，易于洗脱,吸附平衡常数 K

4、a(adsorption equilibrium constant),通常，吸附等温线分为以下三种：(1)直线形等温线(2)凸形等温线(3)凹形等温线,吸 附 等 温 线,一定温度下，组分在固定相中的浓度cS随组分在流动相中的浓度cm的变化曲线,三种吸附等温线和对应的色谱峰形状,吸附较牢固导致延迟,发生其他反应（如氢键作用）,扩散分布中间密，两侧疏,对吸附剂的基本要求：不与流动相和被测组分发生化学反应有高的吸附容量不溶于流动相等,(2)固定相,吸附剂的表面结构是决定色谱柱性能的重要因素，同时它的粒度大小、分布范围、装柱技术等对柱效也有很大影响,硅胶是最常用的吸附剂，由弹性多聚硅酸脱水制成，其吸

5、附能力较氧化铝弱,硅胶(SiO2xH2O),硅胶结构示意图,表面,(使硅胶失去吸附力),+H2O,(能与极性化合物或不饱和化合物形成氢键而具有吸附性),-H2O,加热去水过程称为活化含水量大，吸附活性(能力)低，反之吸附活性高,氧化铝,与硅胶一样，氧化铝也能强烈地吸水，水不易被其它化合物置换，因而使其活性降低通常也采用加热方法使其活化,分离能力强、活性可以控制、应用较广的强极性吸附剂,(3)流动相,流动相又常被称作洗脱剂,对流动相的基本要求：纯度合格对样品有一定的溶解能力，不与样品和吸附剂发生不可逆的化学反应粘度小易流动性质稳定，有一定的挥发性，对分离组分的回收无干扰作用与检测手段相匹配,(4

6、)固定相和流动相的选择,依据被测组分、固定相和流动相的性质,a.被测组分性质（极性大小）烃-羧酸，醇 b.吸附剂的活性 吸附剂的活性越大，对被测组分的吸附能力越强 强极性物质选择弱吸附剂 弱极性物质选择强吸附剂,c.流动相的极性,根据“相似相溶”的原理，对极性大的试样采用极性较强的洗脱剂；对极性弱的试样则采用极性弱的洗脱剂,流动相极性越大，对被测组分的洗脱能力越强洗脱剂的极性强弱可用溶剂强度参数（strength parameter）0 来衡量0 越大，表示洗脱剂的极性越强,氧 化 铝 上 的 洗 脱 序 列,在硅胶吸附剂中0值的顺序与氧化铝相同，数值可按下式换算：,可用两种或两种以上的溶剂，

7、按一定比例组成混合溶剂进行洗脱 也可在洗脱过程中采用逐渐改变混合溶剂的比例，使其性质逐渐变化，使结构相似的组分得到分离，这种洗脱方式称为梯度洗脱(gradient elution)梯度洗脱可提高分离效率，减少色谱峰拖尾现象,d.被测组分、吸附剂和流动相的关系,二、分配柱色谱法(partition chromatography),(1)分离原理,根据试样各组分在两种互不相溶的液体中溶解度不同，即具有不同的分配系数K来实现的(类似于溶剂萃取),又称液液色谱,分离原理示意图(反相),被保留的非极性组分分子,极性溶剂分子,载体（担体）,固定液(非极性或弱极性),平衡时，分配系数=Xs/Xm,Xs:组分

8、X分配在固定相中的浓度Xm:组分X分配在流动相中的浓度,(2)固定相,固定相是涂渍在惰性载体表面上的固定液 担体(support)担体又称载体，仅起负载固定液作用，是惰性的多孔固体颗粒。要求其有较大的比表面积，且对样品无吸附作用 常用的担体有吸水硅胶、硅藻土、纤维素和微孔聚四氟乙烯小球等,分配色谱法要求固定液是样品的良好溶剂，不溶或很难溶于流动相最常用的固定液为：强极性的,-氧二丙腈、中等极性的聚乙二醇和非极性的角鲨烷等常用的固体液涂渍方法主要有三种：溶剂蒸发法，沉淀法和动态涂渍,早期的固定相为机械涂层固定相,固定液易流失,为了解决固定液流失的问题，改善固定相的功能，常用化学方法把有机分子键合

9、到载体(硅胶)表面，形成化学键合固定相(chemical bonded stationary phase),化学键合固定相,以微粒多孔硅胶为载体,硅胶结构示意图,按基团与硅胶相结合的化学键类型分类,1.酯化型（SiOC）,2.硅烷化型（SiOSiC）,应用范围广泛,硅烷化反应：,按有机基团的性质分类,1.极性键合相(正相键合相),2.非极性键合相(反相键合相),C18(ODS)柱应用最广泛,硅胶表面键合极性有机基团(如氰基、氨基和二醇基)常用作正相键合相色谱，分析极性较强的化合物,硅胶表面键合烃基硅烷 常用作反相键合相色谱，分离非极性和极性较弱的化合物,化学键合固定相的优点：传质速度快，柱效高

10、 柱稳定性好，使用寿命长 可键合不同性质的官能团，提高选择性 可利用梯度洗脱，提高分析效率,对流动相的基本要求：与固定液不互溶，极性相差较大；对样品组分的溶解度足够大，但又相对小于固定液对组分的溶解度,(3)流动相,正相分配色谱和反相分配色谱,正相分配色谱(normal phase chromatography)反相分配色谱(reversed phase chromatography),三、离子交换色谱法(ion-exchange chromatography),以离子交换剂为固定相，利用不同待测离子对固定相亲和力的差别来实现分离的液相色谱法，主要用于离子型化合物的分离离子交换色谱的柱填料是一

11、种带电荷官能团的固定基质。固体基质上带负电荷的称为阳离子交换剂，带正电荷的称为阴离子交换剂为保持交换剂的电中性，基质上还存在带相同电荷数但正、负号相反的离子，称为反离子（也称可交换离子）,(1)离子交换原理,离子交换原理示意图,待测组分离子Xm与可交换离子Ym争夺离子交换剂上带电荷的交换基团Rs，进行离子交换,溶剂分子,待测组分X（离子型化合物）,离子交换剂,带电荷的活性基团R,可交换离子Y,其交换反应如下：,反应达平衡时，平衡常数为：,平衡常数 KXY 又称为离子交换反应的选择性系数,(2)固定相,分类,合成树脂(聚苯乙烯)型、纤维素型和硅胶型,微孔型(或凝胶型)、大孔型、薄壳型或薄膜型等,

12、物理涂渍型和化学键合型,离子交换剂的不同物理结构(a)微孔型;(b)大孔型;(c)薄膜型;(d)表面多孔型,离子交换树脂的主要性能指标,聚苯乙烯型合成树脂,交联剂：二乙烯苯（交联形成网状结构）,直链中的聚乙烯链节结构,交联剂是指能在线型结构分子缩聚时起架桥作用而使其分子中的基团互相键合成为不溶网状体的物质 树脂中交联剂的含量叫交联度，以重量百分比表示，范围从1%到16%,每克干树脂能参加交换反应的活性基团数 单位：mmol/g或mmol/ml 反映了树脂进行交换反应能力的大小,离子交换树脂颗粒的大小用树脂溶胀态所能通过的筛孔目数表示制备纯水多用1050目，色谱分析一般为100200目,一般来说

13、，离子强度的变化要大于pH值变化对保留值的影响,(3)流动相,离子交换色谱的流动相大多为水溶液,增加离子强度，削弱试样离子的竞争交换能力，使试样离子保留值降低,流动相pH值的变化，能导致可解离化合物的电离度发生变化，如电离度增大，则试样的保留值也增大,在流动相中添加有机溶剂（如甲醇或乙醇），可使峰的拖尾得到改善，并能调节组分的保留值,分离原理示意图,不具有吸附、分配和离子交换作用机理，而是基于分子的尺寸和形状不同来实现分离,(1)分离原理,又称凝胶色谱或空间排阻色谱,不同尺寸、形状的组分分子,惰性多孔结构的凝胶,四、尺寸排阻色谱法(size exclusion chromatography),

14、凝胶色谱法示意图,一般来说，凝胶色谱适用分离分子量从几千到几百万的试样，且分子量差别需在10%以上时才能得到分离,按相对分子质量降低的次序被洗脱,(2)固定相,按机械强度不同 软质、半硬质及硬质凝胶按化学成分不同 有机和无机凝胶按制备方法和孔穴结构差异 均匀、半均匀和非均匀凝胶按对溶剂的使用范围不同 亲水性、亲油性和两性凝胶,分类：,应用最多的是多孔性凝胶 根据机械强度的不同一般可分为软质、半硬质和硬质凝胶三类 软质凝胶(如葡聚糖等)在压强0.1 MPa左右即被压坏，不适宜用在HPLC中,对流动相的基本要求：,能溶解试样，并且与固定相凝胶性质相似，能浸润凝胶溶剂的黏度要低与采用的检测器相匹配,

15、常用的流动相有四氢呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酰胺和水等,凝胶过滤色谱 水溶液 水溶性样品凝胶渗透色谱 有机溶剂 非水溶性样品,流动相 样品,(3)流动相,依据性能和用途不同可分为三类：(1)分析型(2)制备型(3)专用型,主要由四部分组成：(1)高压输液系统(2)进样系统(3)分离系统(4)检测系统(5)数据记录与处理系统,其他辅助装置：(1)梯度洗脱装置(2)自动进样(3)数据处理系统,第三节 高效液相色谱仪,高效液相色谱仪的工作流程,一、高压输液系统,高压输液系统一般组成：(1)贮液器(2)高压输液泵(high pressure pump)提供动力(3)过滤器(4)压力脉动阻尼器,核心部件,

16、流动相的作用：(1)携带样品通过色谱柱(2)提供分配相，调节选择性，实现分离,用作HPLC流动相的溶剂：有机溶剂、水、无机盐的水溶液等,流动相分为单一流动相和混合流动相,对流动相的基本要求：,1.对被分离样品有适宜的溶解度(K为110)2.与样品及固定相不发生不可逆化学反应3.粘度小，纯度高4.与检测器匹配,流动相的处理：,1.纯化,2.脱气,水：高纯水 有机溶剂：色谱纯,脱气方法：减压脱气(2)煮沸脱气(3)超声波震荡脱气（不会造成组成的变化）,高压输液泵应符合要求：(1)密封性好，耐腐蚀(2)有足够的输出压力 3050 Mpa(3)输出压力平稳，脉冲小(4)输出流量恒定，可调范围宽，流量精

17、度1%2%(5)泵室体积小(0.5 ml),二、进样系统,常用的进样方式有两种：(1)注射器进样(2)六通阀进样 普遍采用,六通阀进样优点：(1)进样时可保持系统高压(2)进样方式简便、易操作(3)进样准确、重现性好(4)自动化程度高(5)适于作定量分析,六通阀进样示意图a.进样位置(样品进入定量管)b.进柱位置(样品导入色谱柱)1.定量管 2.样品进入口 3.流动相进口 4.色谱柱,三、分离系统,分析柱前加一个短的保护柱保持色谱柱的性能,包括色谱柱、恒温器及连接管等,色谱柱 HPLC心脏部件 由色谱柱管和固定相组成,注：HPLC分析通常在室温下进行,四、检测系统,按其应用范围分为通用型和专用

18、型（选择性）,1.紫外检测器（ultraviolet-visible detector,UVD或UV）,2.荧光检测器（fluorescence detector,FD）,3.电化学检测器（electrochemical detector,ED）,5.示差折光检测器（differential reflactive index detector,DRID）,4.蒸发光散射检测器（evaporative light-scatter detector，ELSD）,1.紫外检测器（ultraviolet-visible detector,UVD或UV）,应用最广泛的通用型检测器,工作原理和结构与一般紫

19、外分光光度计相同,被分析组分对特定波长的紫外光或可见光有选择性吸收，待测组分浓度与吸光度的关系服从Lambert-Beer定律,不同之处：将样品池改为体积很小（512 ml）的流通池,流通池示意图1.流动相出口 2.流动相入口 3.透镜,3,2,2,1,1,Z型,H型,光路,紫外检测器的特点：(1)灵敏度高，最小检测浓度为10-10 g/ml(2)线性范围宽，对温度和流动相流速波动不敏感，可 用于梯度洗脱(3)应用范围广泛,紫外检测器的种类,固定波长型,可调波长型,二极管阵列检测器,光源,检测波长,特点,低压汞灯,氘灯,固定254 nm或280 nm,190800 nm连续可调,结构简单，但灵

20、敏度和应用范围受限,应用广泛,三维色谱-光谱图，给出光谱定性信息,190700 nm快速扫描,氘灯,与UVD的主要区别：进入流通池的光是整个紫外-可见光谱区的复合光，当复合光被组分选择性吸收后，其透过光具有了组分的光谱特征，此透过光被光栅分光后，照射到光电二极管阵列上,二极管阵列检测器,以光电二极管阵列作为检测元件,优点：(1)可同时采集不同波长下的色谱图，以计算不同波长的相对吸收比(2)可提供UV-Vis谱，选择最佳检测波长(3)检查色谱峰各个位置的光谱，可以评价物质的纯度(4)可利用色谱保留值规律及吸收光谱综合进行定性分析,二极管阵列检测器光路图,三维色谱-光谱图,2.荧光检测器（fluo

21、rescence detector FD）,原理及仪器结构与荧光分析法相同,荧光检测器的特点：(1)灵敏度更高，比紫外检测器高34个数量级，检测 限可达10-1210-14 g/ml(2)对温度和流动相流速的变化不敏感(3)可进行梯度洗脱,具有荧光特性的样品,受紫外光激发后发射荧光，在一定条件下其荧光强度与荧光物质的浓度成线性关系,选择性检测器,3.电化学检测器（electrochemical detector ED）,对流动相的要求：必须含有电解质（离解常数高，在电极表面呈现惰性）,常用的是安培检测器,检测原理：测量电流与氧化还原物质的浓度成正比,选择性检测器,电化学检测器种类较多，有电导、

22、库仑、极谱、安培、电位等检测器,缺点：(1)需使用缓冲液作流动相(2)电极寿命较短(3)不宜使用梯度洗脱,优点：(1)灵敏度高，检测限可达10-12 g/ml(2)选择性好（具有氧化还原活性的物质）(3)线性范围宽(4)设备简单、成本低、操作方便,4.示差折光检测器（differential reflactive index detector,DRID）,优点：操作简便 缺点：(1)灵敏度不高(2)对温度变化敏感(3)不能用于梯度洗脱,检测原理：,通用型检测器,利用纯流动相和含有被测组分的流动相之间折光率的差别进行检测,HPLC常用检测器主要性能,五、辅助装置,其他辅助装置：(1)梯度洗脱装置

23、(2)自动进样(3)数据处理系统,洗脱方式,等度洗脱,梯度洗脱,溶剂配比保持恒定,流动相组成随时间改变而改变,梯度洗脱装置,低压梯度洗脱装置,高压梯度洗脱装置,一台高压泵,不能改变流动相配比，溶剂消耗量大，自动化程度低,二台或多台高压泵,梯度重复性和精度高，自动化程度高,梯度洗脱(gradient elution)也称溶剂程序,不断改变流动相配比，使溶剂极性、离子强度或pH值改变，从而改进分离，改善峰形、缩短分析时间，以提高分离效率,对组分复杂或容量因子k范围很宽的样品分离很重要,应用HPLC对试样进行分析之前，首先要根据试样的特性来选择一种最合适的分离类型,选择色谱分离类型主要依据：试样的分

24、子量大小、溶解度参数和分子结构等化学性质和物理性质,一、高效液相色谱分离类型的选择,第四节 高效液相色谱法的应用,极性增加,（一）环境样品水中污染物酚的测定,色谱条件：色谱柱：Waters Symmetry C18流动相：溶剂A1%醋酸水溶液 溶剂B1%醋酸乙腈溶液梯度洗脱：溶剂B在20 min内经线性梯度由30%升至100%流速：1.2 ml/min检测器：二极管矩阵检测器,二、应用实例,（二）食物样品孔雀石绿和结晶紫的测定,属于三苯甲烷染料类,色谱条件：色谱柱：ODS-C18柱流动相：乙腈乙酸铵缓冲溶液流速：1.3 ml/min柱温：35 oC荧光检测器：激发波长265 nm，发射波长360 nm,孔雀石绿（MG）和结晶紫（GV）混合标准的HPLC色谱图,（三）生物材料样品尿中马尿酸(HA)和甲基马尿酸(MHA)的测定,尿样的HPLC流出图(a)原尿样，未经经处理；(b)尿样经C18小柱处理；(c)尿样经硅胶小柱处理,色谱条件：色谱柱：C18 流动相：甲醇-水-醋酸 紫外检测器：254 nm,甲苯和二甲苯在尿中的代谢产物,小 结,掌握HPLC的基本理论熟悉HPLC的分类、特点及应用范围了解HPLC和经典液相色谱法、GC的区别了解HPLC的优点,Thank you!,Thank you!,