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1、PCR-RFLP 基因分型方法,-关于序列查找、引物设计和酶切位点分析,概念,聚合酶链式反应连接的限制性片段长度多态性分析,限制性片段长度多态性(restrition fragment length polymophism，RFLP):是指由限制性酶切位点间的插入缺失重排或点突变所引起的基因型间限制性片段长度的变异。,PCR-RFLP:是在 PCR 和 DNA 序列分析基础上产生的 RFLP 技术。该方法是通过 PCR 扩增一段 DNA 片段，然后再选择适当的限制性内切酶，消化 PCR 产物，经电泳，可得到有特异性的电泳谱带，从而达到鉴定不同基因型的目的。,概念,概念,确定基因序列,设计引物,
2、选择内切酶,电 泳,基 因 型,Step by step,基因序列查找,http:/,http:/,http:/expasy.org/sprot/,http:/,基因序列查找,选择gene,输入基因名称,基因序列查找,基因的全称,基因的物种来源,引物设计,引物设计,引物一般原则,基本原则：,1.引物要跟模板紧密结合，2.引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹结构存在，3.引物不能在别的非目的位点引起DNA聚合反应（即错配）。,需要考虑的因素：,引物长度（primer length）、产物长度（product length）、序列Tm值(melting temperature)、G值(inter
3、nal stability)、引物二聚体及发夹结构（duplex formation and hairpin）错误引发位点（false priming site）、引物及产物GC 含量（composition）,引物一般原则,引物的长度：15-30bp，常用的是18-27bp,太短：特异性不好 太长：延伸温度大于Taq酶的最适温度,引物末端要求：3端的序列要比5端重要，引物3端的碱基一般不用A,A在错误引发位点的引发效率相对比较高，5端序列对PCR 影响不大，常用来引进修饰位点或标物。,引物的GC含量：一般为40-60%，以45-55为宜,两条引物之间的GC含量不宜相差太大,引物一般原则,Tm
4、 值：尽量保证两条引物的Tm值相匹配。最 好相差不要大于5 度,引物二聚体及发夹结构的能量：绝对值一般不要超过4.5 最好不要位于3末端,否则容易产生引物二聚体带而且会降低引物浓度从而导致PCR 正常反应不能进行，如果在5末端对反应就没有多大的影响了,G值:反映了引物与模板结合的强弱程度。一般情况下，引物的 G值最好呈正弦曲线形状，即5端和中间G值较高而 3端G值相对较低，且不要超过9。如此则有利于正确引 发反应而可防止错误引发,PCR-RFLP 引物特殊要求,PCR产物的长度：200-1000bp,酶切后产物片断的大小差距：100bp以上,引物设计,工欲善其事，必先利其器,Primer Pr
5、emier 5.0引物设计,Oligo 6.0引物评价,引物设计,新建窗口,输入序列,Primer Premier 5.0,突变位点,选取突变位点前后约500bp长度的碱基,Primer Premier 5.0,引物设计,酶切位点分析,Primer Premier 5.0,自动搜索引物,手动编辑引物,Primer Premier 5.0,前引物的位置（必须超过突变位点）,后引物的位置（必须在突变位点之后）,PCR产物的长度,引物的长度,Primer Premier 5.0,引物的综合评分，分越高引物越好,引物的详细信息,引物序列,Primer Premier 5.0,发夹结构,二聚体,错配,交
6、叉二聚体,Primer Premier 5.0,更高级应用：,参数的设置手动搜索或者修改引物搜索特殊引物（比如单条引物的搜索等）,引物纯化方式的选择,去盐（RPC、Desalted）纯化它是一种对DNA有特异性的吸附的树脂，能有效地去除盐分及小片段的DNA分子。这种引物可以用于常规PCR、DNA测序等实验。PAGE纯化PAGE 纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，对DNA片段进行分离，然后从凝胶中回收目的DNA的方法。PAGE纯化法也是一种非常有效的DNA纯化方法，纯化 后的纯度大于95%，对长链OligoDNA(大于50mer)的纯化特别有效。适用于PCR用引物(如定点诱变引物)，DNA测需
7、用引物，各种探针等。HPLC纯化采用高效液相色谱纯化，产物纯度极高，可达99%。适用于各种基因工程试验，特别是：荧光标记DNA、长链DNA、PCR克隆，定点突变，人工合成基因等。,几种特殊类型的引物设计,引入酶切位点引物设计,Takara定点诱变试剂盒 定点诱变引物设计,Quikchange定点诱变试剂盒 定点诱变引物设计,引入酶切位点引物设计,为什么要引入酶切位点？,突变位点没有内切酶或者合适的内切酶,通过人为的在引物上改变一个碱基从而使之与突变位点的碱基构成新的酶切位点,引入酶切位点引物设计,tctcaacaaaaTcaaaactgtaag,突变位点，找不到合适的内切酶,tctcaacaG
8、aaTcaaaactgtaag,Hinf I可以使用PCR-RFLP的方法基因分型,引入酶切位点引物设计,基本原则：,人为改变原序列上的一个碱基从而与突变位点的碱基构成新的合适的酶切位点,具体要求：,内切酶的选择：便宜、条件稳定和常用。引物的位置：引物3端的最后一个碱基一定不能超过突变位点改变酶切位点的位置：尽量远离突变位点，最好不要紧邻突变位点，一般相隔2-3个碱基引物的长度：在保证引物质量的前提下，尽可能的加长引物的长度。最好不要小于20bp,引入酶切位点引物设计,5.PCR产物的长度：最好能位于100-200bp之间，琼脂糖凝胶电泳时更好区分。6.突变位点附近的引物设计受限，因此，另外一
9、条引物应该尽量设计好。7.在有多种内切酶可供选择时，尽量选择切频率高的基因型的内切酶。以提高灵敏度。,定点诱变引物设计（一）,定点诱变引物设计（一）,定点诱变引物设计（二）,5-ggattcagaatgattctctccaagaaaacatcctttttggatg-33-cctaagtcttactaagagaggttcttttgtaggaaaaacctac-5,酶切位点分析,新建窗口,酶切位点分析,输入序列，注意粘贴的序列不能有空格和段落标记符号,大写突变位点以便于辨认,酶切位点分析,选择菜单AnalyzeRestriction maping,酶切位点分析,酶谱选择点击确定,酶切位点分析,可供选择的限制性内切酶,酶切位点分析,酶切位点个数,酶切位置,酶切后片断大小,电泳,琼脂糖凝胶电泳：操作简便、快捷、灵敏。是分离、鉴定和纯化核酸的首选的标准方法。,聚丙烯酰胺凝胶电泳：分辨力高于普通琼脂糖凝胶电泳，适用于低分子质量蛋白、寡核苷酸的分离和DNA序列的分析。,电泳,凝胶浓度和DNA分子的有效分离范围,电泳,相差25bp,相差34bp,结果分析,祝大家实验顺利,
