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1、第一章 PCR技术原理,定义：PCR技术又称聚合酶链式反应（polymerase chain reaction)，是通过模拟体内 DNA 复制的 方式，在体外选择性地将 DNA 某个特殊区域扩 增出来的技术。,PCR技术:,PCR概念的提出,1971年，美国麻省理工(MIT)教授、1968年诺贝尔医学奖得主Khorana提出“经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。1983，Kary Mullis1993年获得诺贝尔奖,引物,引物,Mullis的构思,DNA聚合酶,DNA聚合酶,技术难点,Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌 DN
2、A 聚合酶 I 的Klenow片段。不耐高温。,thermus aquaticus,Taq DNA聚合酶的发现,1988年Saiki 等从温泉（Hotspring）中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus)中提取到一种耐热DNA聚合酶。,耐高温，在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。酶命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的发现使被PCR广泛应用。在1989年，Science将PCR中的Taq DNA多聚酶命 名为当年的风云分子(Moleculeoftheyea
3、r),Taq DNA聚合酶优点,1、PCR技术的基本原理,在微量离心管中,加入适量的缓冲液,微量的模板DNA,四种脱氧单核苷酸,耐热性多聚酶,一对合成DNA的引物,通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环的反应过程,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍;扩增了特异区段的DNA带。,PCR技术的基本原理和工作方式,模板DNA,2.PCR工作方式,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,引物1,引物2,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,引物1,引物2,Taq酶,Taq酶,PCR的基本原理,PCR
4、反应条件PCR过程PCR的特点,第1轮结束,第2轮开始,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,Taq,Taq,Taq,Taq,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,第2轮结束,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,模板DNA,第1轮扩增,第2轮扩增,第3轮扩增,第4轮扩增,第5轮扩增,第6轮扩增,3.PCR基本材料,模板：单链或双链DNA 引物：16-30 bp合成的寡核苷酸 DNA聚合酶：耐热的DNA聚合酶 底物：四种脱氧三磷酸核苷（dNTP:dATP、dTTP、dCTP、dGTP)Mg2+：DNA聚合酶的激活剂,4.PCR反应程序,94
5、96 30-3 预变性（使模板DNA充分变性）94 30 变性50-60 30-1 复性（使引物与模板充分退火）72 n(按1扩增1kb计算）延伸 72 3-7 总的延伸（使产物延伸完整）4-10 保存,5.PCR要素解析,1）复性和延伸温度 复性的温度是 PCR 扩增是否顺利的关键因素，通常在 50-60 之间。具体的温度主要由引物的 Tm 值决定（低于Tm 值2-3）。延伸温度绝大多数设定为 72。如果复性的温度很高，可以将延伸温度和复性温度设置成同一温度，变成二步法 PCR。2）反应时间 变性一般使用 30 秒钟，如果模板的 G+C 含量较高，或直接用细胞做模板，变性时间可适当延长。复性
6、时间有 30 秒种一般是足够的。延伸时间由扩增产物的大小决定，一般采用 1kb 用 1 分钟来保证充足的时间。,5.PCR要素解析,3）循环次数 循环次数主要与模板的起始数量有关，循环数通常为 2535 次。平台效应（plateau effect）：PCR 扩增过程后期出现的产物的积累按减弱的指数速率增长的现象。原因：底物和引物的浓度已经降低，dNTP 和 DNA 聚合酶的稳定性或活性降低，产生的焦磷酸会出现末端产物抑制作用，非特异性产物或引物的二聚体出现非特异性竞争作用，扩增产物自身复性，高浓度扩增产物变性不彻底。,5.PCR要素解析,4）PCR 反应液的配制顺序 最后加入 DNA 聚合酶。
7、早期的 PCR 仪没有带加热的盖子，要求在反应液上覆盖一层矿物油，防止水分蒸发。热启动（hot start）PCR操作方式可较好解决非特异性扩增的问题。,5.PCR要素解析,5）各种成分浓度作用：缓冲液：提供合适的PH值和DNA聚合酶的激活剂 10mM TrisHCl（），1.5mM MgCl2，50mM K+dNTP（底物）：等摩尔浓度的 4 种 dNTP（即 dATP、dTTP、dCTP和dGTP），终浓度一般为 200mM（即饱和浓度），dNTP 的浓度会影响扩增的产量、特异性和忠实性。引物：1M/L,5.PCR要素解析,模板：单、双链DNA均可。模板的数量会直接影响扩增的效果。模板浓度
8、过 高会导致反应的非特异性增加。DNA聚合酶：最常用的是Taq DNA聚合酶，最适反应温度72。Pfu DNA聚合酶：是目前使用最广泛的具有 3-5 外切活性的 PCR 酶，目前为止错配率最低的高温DNA聚合酶。酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。,长度：至少 16bp，通常为 18-25bp。更短的引物一般会降低扩增的特异性，但会提高扩增的有效性 引物的解链温度：两个引物之间的 Tm 值差异最好在 2-5。对于小于 20 个碱基的引物其 Tm 值可用简易公式计算，即 Tm=4（G+C）+2（A+T）。避免引物内部或引物之间形成引物二聚体（特别是引物的 3端）。G+C 含量：尽量控
9、制在 40%至 60%之间，4 种碱基的分布应 尽可能均匀。尽量避免嘌呤或嘧啶的连续排列，以及 T 在 3 末 端的重复排列。引物的 3 末端最好是 G 或 C，但不要 GC 连排。,5.PCR要素解析：引物设计,6.PCR技术特点,1）高度的灵敏性,引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。,6.PCR技术特点,1）特异性,3）操作简便易行PCR扩增法,只需要数小时,就可以用电泳法检出1g基因组DNA中仅含数个拷贝的模板序列。,6.PCR技术特点,4）用途广泛,生命学科医学工程遗传工程疾病诊断法
10、医学考古学,6.PCR技术特点,1、2Taq PCR MasterMix2、DNA模板3、引物：,本次实验所用材料,PCR反应体系,PCR反应程序,琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原理与其他支持物电泳最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。,琼脂糖,琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中,电荷效应,琼脂糖凝胶具
11、有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中,分子筛效应,DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。,线状DNA片段分离的有效范围与琼脂糖凝胶浓度关系,实验材料,【材料】1.琼脂糖2.10m
12、g/ml EB3.marker4.TAE,实验步骤,【步骤】1、称1.5g琼脂糖，加100ml电泳缓冲液（1TAE）加热熔化。2、胶液冷却至60时，加入4l EB，小心混匀，缓慢倒入制胶模具中，在胶一端插上梳子。3、待胶凝固后，拨出梳子，将模具置于水平电泳槽中，加入1TAE，让液面高于胶面至少1mm。4、上样。5、接通电泳仪电源，1-5V/cm电压（一般80100V），开始电泳。6、根据指示剂迁移位置，判断是否终止电泳。切断电源后，取出凝胶，使用凝胶成像仪进行观察或拍照。,琼脂糖凝胶电泳DNA回收,实验原理,离心吸附柱纯化DNA的原理就是在离心吸附柱内使用一种特殊的硅基质滤膜，这种滤膜在低PH
13、值、高浓度盐（盐酸胍，NaI,NaClO4等）存在的条件下，可以选择性吸附DNA片段，而蛋白质和其它杂质不会被吸附。再通过一系列漂洗、离心等步骤将残留的引物、核苷酸、蛋白质等杂质去除。最后用低盐、高PH值的洗脱缓冲液将纯净的DNA从滤膜上洗脱下来。利用硅基质膜的过滤吸附操作，大大简化了核酸纯化过程，提供了一种快速、高通量的纯化方式。除单管离心柱外，已经有96孔板、384孔板等核酸纯化产品。目前，硅基质膜吸附法已经成为目前核酸分离纯化最主流的技术。通过该技术纯化的DNA片段可直接用于的酶切、连接、测序、标记和杂交等各种常规分子生物学操作。,试剂盒组成及储存方法,实验步骤,注意事项,切胶回收DNA时，应尽量使用能量较低的长波长紫外线，并缩短操作时间，以减少紫外线对DNA的损伤。第一次使用前先在漂洗液W2中加入指定量的无水乙醇，加入后及时做好标记，以免多次加入。各种溶液使用后应及时盖紧，以避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化。所有操作在室温完成。若溶液沾染皮肤、眼睛时，立即用大量清水冲洗。适当减小洗脱体积可提高回收DNA的浓度。但体积小于30l将降低洗脱效率。,凝胶电泳检测,
