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1、免疫学实验技术,Immunological experiment technique,一、免疫细胞分离与功能测定技术1.免疫细胞分离与纯化2.免疫细胞功能测定,二、免疫分子的检测技术1.细胞膜分子2.可溶性分子,1.免疫细胞分离与纯化(B细胞、T细胞、NK细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、DC、红细胞等)2.免疫细胞功能测定,一、免疫细胞分离与功能测定技术,1）单个核细胞分离 葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法 Percoll不连续密度梯度离心法,除去,分离,1、免疫细胞分离与功能测定,1）单个核细胞分离,多次洗涤除去血小板低渗或氯化铵溶解红细胞黏附除去单核细胞 L亮酸甲酯除去单核细胞、NK、Tc集团铁
2、除去单核细胞免疫吸附分离除去单核细胞免疫磁珠分离除去单核细胞,2）淋巴细胞纯化,尼龙棉柱分离,6mm,T细胞,B细胞,3）B细胞、T细胞分离,E花环分离,3）B细胞、T细胞分离,免疫吸附分离,羊抗鼠Ab,3）B细胞、T细胞分离,B,B,B,免疫磁珠分离法,免疫磁珠法分离细胞 细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合，在外加磁场中，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中，无该种表面抗原的细胞由于不能与连接着磁珠的特异性单抗结合而没有磁性，不在磁场中停留，从而使细胞得以分离。,免疫磁珠分离法,免疫磁珠法分为阳性分离法和阴性分离法：阳性分离法磁珠结合的细胞就是所要分离获得的细胞 阴性分离法
3、磁珠结合不需要的细胞，游离细胞为所需细胞 一般而言，阴性分离法的磁珠用量比阳性分离法的大，阳性分离法用行更多。,磁珠分离细胞的重要指标是：纯度和得率：取决于磁珠所连接单抗的特异性和磁珠大小（磁性），然而太大的磁珠会影响细胞活性。目前市场上有2种磁性细胞分离系统：*Small particles(50 nm)MACS*Large particles(12004500 nm)others（如Dynal）,小磁珠 优点：分离后续培养、可上流式检测 缺点：强的磁场、速度慢得率低、成本昂贵大磁珠 优点：试管中完成（简单）、易于增减细胞用量、速度快得率高、成本低；缺点：影响细胞活性不利于培养、纯度低、容易
4、阻塞FCM的喷嘴；,优点与缺点,flow cytometry,T细胞增生(转化)试验 T细胞介导的细胞毒试验原理 T细胞功能的体内检测法 流式细胞术 T分泌细胞因子功能测定,4）T细胞功能测定,T分泌细胞因子功能测定,T分泌细胞因子功能测定,T分泌细胞因子功能测定,T分泌细胞因子功能测定,B细胞转化试验 溶血空斑形成试验 反向溶血空斑试验 酶联免疫斑点法,5）B细胞功能测定,酶联免疫斑点法,酶联免疫斑点法,酶联免疫斑点法,酶联免疫斑点法,1)形态学检查法 2)51Cr放射性核素释放法 3)酶释放法：4)化学发光法 5)流式细胞术,6）NK细胞活性测定,51Cr放射性核素释放法,6）NK细胞活性
5、测定,1)中性粒细胞趋化功能测定 2)中性粒细胞吞噬功能测定,7）吞噬细胞功能测定,3)巨噬细胞吞噬功能测定 4)巨噬细胞胞毒作用,7）吞噬细胞功能测定,8）DC分离与纯化,分离DC的原理是依据树突状细胞的低密度和半粘附特性:具有轻度暂时性粘附特性-从而可以和其他非粘附细胞、巨噬细胞；,8）DC分离与纯化,小鼠脾脏DC是1974年首次分离获得的：利用DC半粘附性将脾脏内单个核细胞培养3小时后，洗去非粘附细胞（淋巴细胞），纯度约为40%-60%；采用培养板亲和粘附提高了DC的纯度80-90%，操作方便、花费小、但提取的量较少；,8）DC分离与纯化,免疫磁珠法分离（CD11c）分离诱生法:主要是采
6、用直接分离和细胞因子诱生相结合的方法,依次去除红细胞、T、B细胞、粒细胞、单核-巨噬细胞等而获得纯化树突状细胞及其前体，再联合细胞因子诱导下培养；应用细胞因子诱导人体CD34 细胞定向分化为树突状细胞近年来已有大量文献报道；,9）红细胞功能测定,1930年Duke和Wallace发现锥虫在抗血清及补体参与下，可黏附到人类红细胞膜上，并发现不同人红细胞对锥虫的黏附能力不同，推测在红细胞膜上存在者一种与免疫有关的物质。1953年Nelson报道，型肺炎双球菌可以被补体调理结合到人红细胞膜上，此现象称为免疫黏附，这种黏附需激活补体C3，而不需要激活下游的补体成分，认为红细胞膜上可能存在免疫黏附受体。
7、,9）红细胞功能测定,直到1963年Nishioka证实这种免疫黏附现象是通过人红细胞膜补体C3受体(现称CRl或 CD35)而实现的。1980年Fearon详细研究CD35性质，表明85%的CD35存在红细胞膜上。1981年Siegel在前人研究的基础上发现红细胞可黏附肿瘤细胞、血清中存在抑制红细胞黏附因子、红细胞膜上过氧化物酶活性与CD35活性相关等多种免疫功能，提出了“红细胞免疫系统”的概念，1982年在开展红细胞免疫的研究；,10）干细胞分离与鉴定,1.细胞膜分子：黏附分子、受体、配体、胞浆蛋白等细胞成分；免疫标记技术2.可溶性分子：Ig、细胞因子、可溶性黏附分子、可溶性受体、细胞分泌
8、的各种分子等等 免疫标记技术 生物学活性测定（IL-2等）分子生物学测定（mRNA等）,二、免疫分子的检测技术,免疫标记技术,免疫标记技术,标记免疫学创立于60年代初期，开始以放射免疫分析为代表，以后相继派生出许多其它的标记免疫分析方法。60年代末期创立了免疫放射分析，其灵敏度、特异性、线性范围均好。70年代初建立.酶标记免疫分析，价格低，检测方便，无放射性污染。70年代中期，发光信号进行酶免分析建立，灵敏度高，快速。,1.标记免疫分析的发展过程,90年代中期发展起全自动的化学发光免疫分析仪。80年代初期时间分辨荧光免疫分析问世，已经显示出其良好的发展前景。用时间分辨技术(波长和时间两种分辨)
9、测量荧光，有效地排除非特异荧光，大大地提高了分析的灵敏度，稳定性好，有效期长，测量速度快，易于自动化，因此被公认为有良好发展前景的非放射性标记免疫分析方法之。重点：提高灵敏度和特异性两大问题。,1.标记免疫分析的发展过程,2.标记免疫分析的分类1,标记免疫分析的基本原理：按照示踪标记物及标记技术分类：1放射性元素标记免疫分析2酶标记免疫分析3荧光标记免疫分析 4金银标记免疫分析5.化学发光免疫分析,2.标记免疫分析的分类1,2.标记免疫分析的分类2,按反应体系的物理状态分类：1.均相标记免疫分析2.非均相标记免疫分析 放射性核素分析 酶标记免疫分析 荧光标记免疫分析 化学发光免疫分析 电化学发
10、光免疫分析按照检测对象不同进行分类讲解：,免疫细胞化学技术,一.免疫荧光细胞化学技术-常用荧光素,1.常用荧光素 异硫氰酸荧光素(FITC)：呈黄绿色四乙基罗丹明(RB200)：呈橙红色，荧光效率较低。四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)：橙红色荧光，与FITC的黄绿色荧光对比清晰，常用于双标记示踪。藻红蛋白(phycoerythfin，PK)：在流式细胞术(FCM)中较常用。7-氨基-4-甲基香豆素(7-amino-4-methylcoumarin，AMC)：用于双标记或多标记。,CellAg,一.免疫荧光组织化学技术-常用方法1,1).直接法 荧光素标记抗体-抗原,一.免疫荧光组织化学技术-
11、常用方法2,CellAg,2).间接法抗原-已知未标记抗体-荧光素标记的抗抗体,一.免疫荧光组织化学技术-常用方法3,CellAg,补体,3).补体法 直接法 间接法切片中抗原抗体与补体混合液荧光素标记抗补体,4).双重免疫荧光染色法 可在同一标本上定位、定性检测两种抗原。如A抗原的抗体用罗达明(RB200)标记，呈桔红色，而B抗原的抗体用FITC标记呈黄绿色，镜下两种不同激发光，就可以检测不同的抗原成分。常用下列染色法：一步双染色法：二步双染色法：,一.免疫荧光组织化学技术-常用方法4,一.免疫荧光组织化学技术-常用方法4,二.免疫酶组化技术-常用酶,酶标记法：酶交联结合在抗体上，形成酶标记
12、抗体 非标记抗体技术：酶作为抗原与相应特异性抗体连接,二.免疫酶组化技术-常用酶,1.常用酶 辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)：底物为H202，以二氨基联苯胺(DAB)、邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)、ABTS为供氢体的反应产物可观察或进行比色测定。碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，AP)：底物为对硝基苯磷酸盐(PNP)、-甘油磷酸钠、磷酸萘酯等。葡萄糖氧化酶(gucose oxidase，GOD)：葡萄糖为底物的酶，供氢体为对硝基蓝四氮唑(nitroblue tetrazolium，NBT)，酶促反应的终产物为不溶性的蓝色
13、沉淀，比较稳定。,二.免疫酶组化技术-常用酶,过氧化物酶-抗过氧化物酶复合物(peroxidase-anti peroxidase,PAP)碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶复合物(alkaline phasphatase-antialkaline phasphatase,APAAP),酶标记抗体免疫组化常用方法1,1).直接法 酶标记抗体与组织细胞内相应抗原反应,酶标记抗体免疫组化常用方法2,人CellAg,底物,2).间接法 抗原抗体酶标抗抗体复合物，通过酶底物显色。,酶标记抗体免疫组化常用方法3,人CellAg,底物,3).酶标抗体三步染色法 由于酶分子的增加，增强了方法的敏感性。,非标记抗体免疫酶
14、组化常用方法1,1).酶桥法 靶抗原特异性抗体(如兔抗人)-二抗即桥抗体(如羊抗兔)抗酶抗体(如兔抗酶)酶液显色。,人CellAg,底物,非标记抗体免疫酶组化常用方法2,2).PAP法 靶抗原特异性抗体(如兔抗人)过量桥联抗体(如羊抗兔)PAP复合物(如兔PAP)底物显色。,人CellAg,兔抗人Ab,羊抗兔Ab,3).APAAP法 靶抗原抗体(如兔抗人)二抗即桥联抗体(如羊抗兔)复合物(如兔 APAAP)底物显色。,人CellAg,非标记抗体免疫酶组化常用方法3,4).双PAP法,人CellAg,非标记抗体免疫酶组化常用方法4,三.亲合免疫组织化学技术常用方法,1.生物素-亲合素技术1).亲
15、合素生物素过氧化物酶技术(avidin biotin-pemxidase complex technique，简称ABC技术)ABC系统广泛应用于免疫学检测技术。2).桥联亲合素生物素技术(Bridged Avidin-Biotin technique，BRAB技术)3).标记亲合素生物素技术(Labelled Avidin-Biotin technique，LAB技术)2.葡萄球菌A蛋白(SPA)3.凝集素 1).直接法 2).间接法 3).糖凝集素糖法 4.链霉亲合素生物素技术(labelled streptavidin biotinmethod，LSAB):,三.亲合免疫组织化学技术常用
16、方法,ABC法：人组织标本靶抗原第一抗体(如鼠抗人)生物素标记的第二抗体(如biotin羊抗鼠)等量的亲合素和酶标生物素混合液底物显色。,人CellAg,四.免疫金银及铁标记免疫组化技术,人组织标本靶抗原-抗体(如兔抗人)-金标二抗(如金标羊抗兔)-金颗粒呈红色（银显影液作用后银颗粒呈棕黑色、胶体铁通过普鲁蓝反应呈蓝色）,人CellAg,兔抗人Ab,金,羊抗兔Ab,人CellAg,免疫标记测定技术,1.荧光偏振免疫分析(fluorescence polarization immunoassay，FPIA)2.均相荧光免疫分析(homogeneous fluorescence immunoass
17、ay)荧光激发传递免疫分析法(fluorescence excitation transfer immunoassay)已用于吗啡和IgG等的定量测定。,一、荧光免疫测定技术,荧光猝灭免疫测定法(fluorescence quenching immunoassay)粒子浓缩荧光免疫分析(particle concentration fluorescence immunoassay，PCFIA)时间分辨荧光免疫测定(time-resolved fluoro-immunoassay，TrFIA)荧光激活细胞分类仪：流式细胞术,一、荧光免疫测定技术,荧光偏振免疫分析仪,流式细胞仪,二.放射免疫分析,
18、1.放射免疫测定(radioimmunoassay，RIA)原理：标记抗原和未标记待测抗原对有限量抗体的竞争性结合(或竞争性抑制)反应。,有限的Ab,二.放射免疫分析,2.放射受体分析(radioreceptor assay，RRA)原理：与免疫放射测定相似。用于测定受体的亲和常数、解离常数、受体结合数以及定位分析等。3.免疫放射测定(immunoradioimetric assay IRMA)原理:待测抗原与过量标记抗体的非竞争结合反应，然后加入固相的抗原免疫吸附剂以结合游离的标记抗体，离心除去沉淀，测定上清液中放射性强度，从而推算出检晶中抗原含量,三.酶免疫测定(enzyme immuno
19、assay，EIA),酶免疫测定分类：非均相酶免疫测定(heterogeneous enzyme immunoassay)均相酶免疫测定(homogeneous enzyme immunoassay)常用标记酶：HRP、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等。,三.酶免疫测定(enzyme immunoassay，EIA),非均相酶免疫测定(heterogeneous enzyme immunoassay)是目前应用最广泛，又分为：固相酶免疫测定：琼脂糖珠(Sepharose 4B)作为载体的DASS体系 聚苯乙烯及其他固相支持物的酶联免疫吸附试验 液相酶免疫测定,1.固相酶免疫测定常用方法1,(1)间接
20、法：已知抗原吸附固相载体-待检抗体-洗涤-酶标抗抗体-底物显色-目测或酶标仪测光密度值定量测定,1.固相酶免疫测定常用方法2,(2)双抗体夹心法：已知抗体吸附固相载体-待检抗原-洗涤-酶标抗体-底物显色,1.固相酶免疫测定常用方法3,(3)竞争法：测定抗原：测定抗体：,1.固相酶免疫测定常用方法4,(4)MAC-ELISA：捕获法测IgM的酶联免疫吸附试验(简称MAC-ELISA)，抗人IgM(链)抗体包被固相载体-待检血清IgM-洗涤-特异性抗原-酶标抗体-底物显色,底物,1.固相酶免疫测定常用方法5,(5)斑点ELISA(dot-ELISA)吸附蛋白质能力强的硝酸纤维素膜(NC膜)为载体，
21、进行间接法或夹心法，呈色斑点，常用于筛选单克隆抗体杂交瘤细胞；在各种病毒性疾病和寄生虫病的临床诊断与血清流行病学调查中亦广泛使用。,杂交瘤细胞,(6)ABC法,NC膜,1.固相酶免疫测定常用方法7,(7)免疫印记,能分离分子大小不同的蛋白质并确定其分子量，常用于检测多种病毒的抗体或抗原，如抗HIV抗体的检测。,2.液相酶免疫测定,液相酶免疫测定 在液相中进行的抗原抗体反应达到平衡后，需加分离剂将游离的酶标记物分离，然后再加底物显色测定。分为平衡法和非平衡法两类。(1)非平衡法亦称连续饱和法(2)平衡法,3.均相酶免疫测定,方法多样，原理复杂，共同点通过抗原抗体反应使标记物活性改变(1)酶放大免
22、疫测定技术(enzyme-multiphedimmunoassay technique，EMIT)基本原理:半抗原+酶结合成酶标半抗原=保留半抗原和酶的活性当酶标半抗原+抗体结合=酶的活性被抑制检测对象为标本中的半抗原,(1)酶放大免疫测定技术基本原理,酶,底物,半Ag,底物,(2)克隆酶供体免疫测定,四.金免疫技术(immunogold labelling technique),(1)胶体金的特性：1胶体性质 2呈色性 3.光吸收性(2)胶体金标记技术在免疫学试验中的应用:1.胶体金标记抗体在流式细胞术中的应用 2.胶体金标记在液相免疫测定3.固相免疫金银法 1)斑点免疫金银染色法 2)斑点
23、金免疫渗滤测定法 3)斑点免疫层析试验：也以硝酸纤维素膜为载体，但利用了微孔膜的毛细管作用，滴加在膜条一端的液体慢慢向另一端渗移。,五.发光免疫分析,1.化学发光免疫分析 2.化学发光酶免疫分析 3.生物发光免疫分析 4.电化学发光免疫分析,六.免疫PCR(IM-PCR),原理：是将抗原抗体反应的特异性与体外扩增DNA的技术相结合，用于检测生物样品中含量极少的蛋白质比ELISA敏感10万倍，敏感性可达几百个待检分子。按反应中所用抗体的方式不同可分为：1）直接IM-PCR法 2）双抗体夹心IM-PCR,六.免疫PCR(IM-PCR),免疫学检测技术展望1、客观性2、特异性3、敏感性4、定性5、定量6、定位7、免疫检测技术选择,谢谢！,
