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1、5 分子生物学研究方法（上）DNA、RNA及蛋白质操作技术,从20世纪中叶开始，分子生物学研究得到高速发展，主要原因之一是研究方法，特别是基因操作和基因工程技术的进步。基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因人工合成、定点突变和PCR扩增等，是分子生物学研究的核心技术。,基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。基因工程技术是核酸操作技术的一部分，只不过它强调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达。事实上，这种跨越物种屏障、
2、把来自其它生物的基因置于新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程技术区别于其它技术的根本特征。,5.1 重组DNA技术回顾,三大成就40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；50年代提示了DNA分子的双螺旋结构模型和半 保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；50年代末至60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。,限制性内切酶,限制性核酸内切酶能够识别DNA上的特定碱基序列并从这个位点切开DNA分子。1972年Boyer实验室第一个发现了核酸内切酶EcoRI的识别序列。命名：
3、Escherichia coli RY13 中第一个内切酶 EcoRI.,EcoRIEcoRVBsaISfiI,有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶子序列，这类酶称为同裂酶。同裂酶的切割位点可能不同，识别和切割位点都相同的叫同序同切，识别位点相同但切割位点不同的叫同序异切酶。,一类识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能酶切产生相同黏性末端的限制性内切酶。由同尾酶产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用彼此连接起来的。,双酶切,单酶切,质粒是真核细胞细胞核外或原核生物拟核区外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器（主要指线粒体和叶绿体）中和细菌细胞拟核区以外的环状脱氧
4、核糖核酸(DNA)分子。现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体DNA以外的DNA分子。在基因工程中质粒常被用做基因的载体(Vector)。严紧型质粒，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有12个质粒。松弛型质粒，当染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细胞 内一般有10-200份拷贝，如果用一定的药物处理（如氯霉素）抑制寄主蛋白质的合成还 会使质粒拷贝数增至几千份。功能：进行细胞间接合，并带有一些基因，如产生毒素、抗药性、固氮、产生酶类、降解功能等。,质粒,载体：多数质粒都含有半乳糖苷酶的前146个AA编码序列和调控序列。编码序列中包含了一个MCS，它不破坏读码框
5、，不影响功能。宿主菌：编码半乳糖苷酶C端部分序列。分别编码的片段均无活性，但可融为一体，形成具有酶活的蛋白质。,C,重组DNA实验中常见的主要工具酶,转化外源DNA的进入而使细胞遗传性改变称为转化。早在1943年，Avery等就发现有毒肺炎双球菌的DNA与无毒肺炎双球菌共培养后产生有毒性的肺炎双球菌后代的转化现象。由于天然状态下DNA进入细胞的效率很低，在分子生物学和基因工程工作中可采取一些方法处理细胞，经处理后的细胞就容易接受外界DNA，称为感受态细胞，再与外源DNA接触，就能提高转化效率。例如大肠杆菌经冰冷CaCl2的处理，就成为感受态细菌，当加入重组质粒并突然由4转入42作短时间处理，质
6、粒DNA就能进入细菌；用高电压脉冲短暂作用于细菌也能显著提高转化效率，这称为电穿孔（electroporation）转化法。,将连接有所需要的DNA的载体导入宿主细胞的常用方法有四种：转化，用质粒作载体所常用的方法。转染，用噬菌体DNA作载体所用的方法，这里所用的噬菌体DNA并没有包上它的外壳。转染是转化的一种特殊形式。转导，用噬菌体作载体所用的方法，这里所用的噬菌体DNA被包上了它的外壳，不过这外壳并不是在噬菌体感染过程中包上，而是在离体情况下包上的，所以称为离体包装。注射，如果宿主是比较大的动植物细胞则可以用注射方法把重组DNA分子导入。,核酸凝胶电泳技术细菌转化与目标DNA分子的增殖聚合
7、酶链反应技术实时定量PCR、基因组DNA文库构建,5.2 DNA基本操作技术,5.2.1 核酸凝胶电泳技术,在生理条件下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，呈离子化状态，DNA和RNA多核苷酸链称为多聚阴离子，把它们放置在电场当中，会向正电极的方向迁移。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度，取决于核酸分子本身的大小和构型。这就是应用凝胶电泳技术分离DNA片段的基本原理。,准备胶板,配制琼脂糖凝胶,倒胶,上样,溴化乙锭由于插入了溴化乙锭分子，在紫外光照射下，琼脂糖凝胶电泳中
8、DNA的条带便呈现出橘黄色荧光，易于鉴定。,DNA的迁移速度与构型有关,用酚、氯仿法从工程菌中提取的质粒一般有三种构像，即超螺旋，线形和开环。（开环质粒是指双链环状的质粒DNA有部分解链，因此电泳速度最慢）三种构像的质粒在琼脂糖电泳的前后顺序是超螺旋线形开环，线形的质粒在中间，而开环的质粒在最后。判断质粒质粒好坏的一个指标就是超螺旋质粒在所以质粒中的含量。,聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),原理：聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE)主要是以PAGE为介质，根据DNA分子大小和电荷分离DNA分子。染色：银染法进行显色。银染的原理：1.银离子（一般是AgNO3)和DNA结合；2.还原剂甲醛把Ag+还原成银
9、颗粒，最终DNA呈现为黑褐色。特点：根据被分离物质分子大小和分子电荷多少来分离 分离鉴定低分子量蛋白质、小于1Kb的DNA片段和DNA序列分析 分离长度仅相差0.1%（即1000bp中的1bp）的核苷酸分子,聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体，在催化剂TEMED(N,N,N,N-四甲基乙二胺）和过硫酸铵的作用下，丙烯酰胺聚合形成长链，聚丙烯酰胺链在交联剂N,N-亚甲双丙烯酰胺参与下，聚丙烯酰胺链与链之间交叉联接而形成凝胶。聚丙烯酰胺凝胶孔径的大小是由丙烯酰胺和交联剂的浓度及比例决定的。,普通的琼脂糖凝胶电泳，很难分离大于50kb的DNA分子，而要进行超大分子研究，要用到脉冲电场凝胶电泳(PFGE)
10、,脉冲电场凝胶电泳原理,在脉冲电场中，DNA分子的迁移方向随着电场方向的周期性变化而不断改变。由于琼脂糖凝胶的电场方向、电流大小及作用时间都在交替变化，使得DNA分子能够随时调整其游动方向，以适应凝胶孔隙的无规则变化。与相对分子质量较小的DNA相比，相对分子质量较大的DNA需要更多的脉冲次数来更换其构型和方位，使其按新的方向游动。应用脉冲电场凝胶电泳技术，可成功分离到高达107bp的DNA大分子。,脉冲电场凝胶电泳效果,产气荚膜梭菌,5.2.2 细菌转化与目标DNA分子的增殖,准备转化态细胞,42热冲击,电转化,加入外源DNA,细胞复苏,平板筛选,CaCl2,10%甘油,蓝白斑筛选,+抗生素+
11、IPTG+X-gal,要灵活运用，根据不同情况设计筛选策略！,电转化仪,利用噬菌体颗粒能够有效将DNA注入到宿主细胞这一特点，科学家又发明了DNA分子的体外包装法,延伸：其他基因导入方法,5.2.3 聚合酶链反应技术,模板引物DNA聚合酶dNTPMg2+,变性,退火,延伸,PCR引物设计：引物的长度一般为15-30 bp。引物在模板内最好具有单一性，特别是3端。引物序列的GC 含量最好在40一60，且上下游引物序列GC含量的差异不要太大。避免形成稳定的引物二聚体和发夹结构。,引物二聚体,引物特异性差（不专一）,聚合酶（Taq酶）,Taq酶是从水生栖热菌 Thermus Aquaticus（Ta
12、q）中分离出的具有热稳定性的DNA 聚合酶。与一般酶不同,用Taq酶扩增DNA时常使3端凸出一个A，可用于TA Cloning.,高保真PCR酶利用自身的35外切酶活性（pfu DNA Polymerase，PrimeSTAR HS DNA Polymerase等）能保证PCR产物的保真度，但扩增的PCR产物为不带A尾的平末端DNA片段，不能直接TA克隆。,RT-PCR(反转录PCR),5.2.4 实时定量PCR,什么是Real Time PCR?,在PCR反应体系中加入荧光基团利用荧光信号累积实现了实时监测整个PCR进程，对起始模板进行定量分析的方法,与普通PCR的区别,普通PCR:在PCR
13、结束后对终点产物进行定量分析。Real Time PCR:实时检测PCR扩增，在扩增的指数期对起始模板进行定量。,Real Time PCR的数学原理,Real Time PCR的数学原理,Ct的定义:扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环数。此时扩增是呈对数期增长。C-Cycle t-threshold,Real Time PCR的数学原理,Ct值与模板的关系,研究表明,每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,其实拷贝数越多,Ct值越小.利用已知拷贝数的标准品可作出标准曲线,其中横坐标代表起始拷贝数的对数,纵坐标代表Ct值.因此,只要获得Ct值,即可从标准曲线上获
14、得模板的起始拷贝数,Real Time PCR的化学原理,根据Real Time PCR的化学发光原理可以分为2 大类：,探针类:包括TaqMan探针和分子信标，利用与靶序列 特异杂交的探针来指示扩增产物的增加 非探针类:其中包括如SYBR Green I 或者特殊设计的引 物(如LUXPrimers)通过荧光染料来指示产物的 增加。,Real Time PCR的化学原理,TaqMan探针,TaqMan探针是最早用于定量的方法。在PCR 扩增时加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸：5端标记一个报告荧光基团，3端标记一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被
15、淬灭基团吸收，也就是FRET 反应；PCR 扩增时，Taq 酶的53外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR 产物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB 探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。,Real Time PCR的化学原理,TaqMan探针,的FRET,Real Time PCR的化学原理,TaqMan探针,数量关系:,每产生一条DNA链，就切断一条探针 每切断一条探针，就产生一个单位信
16、号 信号强度与结合探针的DNA分子数成正比,优点:对目标序列的高特异性-阴性结果确定引物设计相对简单重复性比较好缺点:只适合一个特定的目标委托公司标记，价格较高,Real Time PCR的化学原理,PCR反应的构建,TaqMan探针,Real Time PCR的化学原理,SYBR Green 法,SYBR Green I 是一种结合于小沟中的双链DNA 结合染料，与双链DNA 结合后，其荧光大大增强。,Real Time PCR的化学原理,SYBR Green 法,工作机理:SYBR Green只有和双链DNA结合后才发荧光变性时，DNA双链分开，无荧光在延伸结束阶段采集荧光信号。SYBR
17、Green也能和非特异的双链DNA结合发光，所以必须在反应结束 时做熔解曲线分析。,Real Time PCR的化学原理,SYBR Green 法,熔解曲线分析,Real Time PCR的化学原理,SYBR Green 法,SYBR Green PCR反应体系的建立和优化SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物反应Buffer 体系的优化反应温度和时间参数:由酶和引物决定其他与常规PCR相同,优点:对DNA模板没有选择性-适用于任何DNA使
18、用方便-不必设计复杂探针非常灵敏便宜缺点:容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件对引物特异性要求较高,SYBR Green 法,Real Time PCR的化学原理,SYBR Green 法,数量关系:每形成一个DNA双链，就有一定数量的染料结合上去染料一结合，就产生荧光信号信号强度与DNA分子总数目成正比,Real Time PCR的化学原理,Real Time PCR的应用,绝对定量(Absolute Quantification，AQ)病原体检测转基因食品检测基因表达研究 相对定量(Relative Quantification，RQ)基因在不同组
19、织中的表达差异药物疗效考核耐药性研究,实时PCR分析,Real Time PCR的应用,等位基因分型(Allelic Discrimination，AD)基因突变分析SNP研究物种鉴定、菌株鉴定 阴性阳性鉴定(Plus/Minus with IPC，+/-),终点分析,5.2.5 重亚硫酸盐测序技术,确定某个碱基位点的甲基化情况,注意：引物设计、多次测序避免产生同源测序。,5.2.6 基因组DNA文库的构建,从生物组织细胞提取出全部DNA将其切成预期大小的片段，分别与载体连接，转入受体细菌或细胞，形成克隆。这样每一个细胞接受了含有一个基因组DNA片段与载体连接的重组DNA分子，而且可以繁殖扩增
20、，许多细胞一起组成一个含有基因组各DNA片段克隆的集合体，就称为基因组DNA文库。如果这个文库足够大，能包含该生物基因组DNA全部的序列，就是该生物完整的基因组文库。,用噬菌体建立DNA文库示意图其他载体：bacterial artificial chromosome(BAC)p1 artificial chromosome(PAC)yeast artificial chromosome(PAC),5.3 RNA基本操作技术,总RNA的提取mRNA的纯化cDNA的合成cDNA文库的构建基因文库的筛选,5.3.1 总RNA的提取,RNA易遭降解，实验要求较严格。总RNA提取的方法有多种，主要有L
21、iCl法、CTAB法、异硫氰酸胍法（TriZol）。异硫氰酸胍法（TriZol）原理：TRIZOL试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层（无色）主要为RNA，有机层（黄色）主要为DNA和蛋白质。,5.3.2 mRNA的纯化,5.3.3 cDNA的合成,5.3.4 cDNA文库的构建,cDNA 文库是指某生物某发育时期所转录的全部 mRNA 经反转录形成的 c
22、DNA 片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。经典 cDNA 文库构建的基本原理是用 Oligo(dT)作逆转录引物，或者用随机引物，给所合成的 cDNA 加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得文库。步骤：在获得高质量的 mRNA 后，反转录合成cDNA，合成接头的加入、将双链 DNA 克隆到载体中去、分析 cDNA 插入片断，扩增 cDNA 文库、对建立的 cDNA 文库进行鉴定。这里强调的是对载体的选择，常规用的是 噬菌体，这是因为 DNA 两端具有由12个核苷酸的粘性末端，可用来构建柯斯质粒，这种质粒能容纳大片段的外源 DNA。,5.3.4 基因文库的筛选,基因文库的筛选是指通过某种
23、特殊方法从基因文库中鉴定出含有所需重组DNA分子的特定克隆的过程。筛选方法有很多种，常用的有：核酸杂交法PCR筛选法免疫筛选法,核酸杂交法,PCR筛选后稀释,PCR筛选后稀释,PCR筛选后稀释,PCR筛选法,免疫筛选法,5.4 基因克隆技术,在多细胞的高等生物个体水平上，人们用克隆（clone）表示由具有相同基因型的同一物种的两个或数个个体组成的群体。从同一受精卵分裂而来的单卵双生子（monozygotic twins）便是属于同一克隆。在细胞水平上，克隆一词是指由同一个祖细胞（progenitor cell）分裂而来的一群遗传上同一的子细胞群体。在分子生物学上，人们把将外源DNA插入具有复制
24、能力的载体DNA中，使之得以永久保存和复制这种过程称为克隆。,5.4.1 RACE技术,RACE（rapid amplification of cDNA ends,cDNA末端快速扩增）是一种获得转录本5或3未知序列的方法。它根据已知序列设计基因片段内部特异引物，用cDNA进行PCR扩增得到目的序列。用于扩增5端的方法称为5RACE，用于扩增3端的称为3RACE。已知cDNA序列可来自序列表达标签、减法cDNA库、差法显示和基因文库筛选。,5.4.2 应用cDNA差示法分析克隆基因,cDNA差示分析法（representational difference analysis,RAD）充分发挥了
25、PCR能以指数形式扩增双链DNA模板，仅以线形形式扩增单链模板的特性，通过降低cDNA群体复杂性和更换cDNA两端接头等方法，特异性扩增目的基因片断。,加去磷酸化的接头,混合、变性、复性,填平粘性末端,指数扩增,线性扩增,无扩增,以 为引物的PCR,试验材料Tester,探针材料Driver,加去磷酸化的接头,混合、变性、复性,填平粘性末端,指数扩增,线性扩增,无扩增,以 为引物的PCR,试验材料Tester,探针材料Driver,5.4.3 Gateway大规模克隆技术,Gateway技术是基于已研究的非常清楚的噬菌体位点特异重组系统（attB x attP attL x attR）。BP和
26、LR两个反应就构成了Gateway技术。BP反应是利用一个attB DNA片段或表达克隆和一个attP供体载体之间的重组反应，创建一个入门克隆。LR反应是一个attL入门克隆和一个attR目的载体之间的重组反应。LR反应用来在平行的反应中转移目的序列到一个或更多个目的载体。,5.5 蛋白质组与蛋白质组学技术,蛋白质组学（Proteomics）一词，源于蛋白质（protein）与基因组学（genomics）两个词的组合，意指“一种基因组所表达的全套蛋白质”，即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。蛋白质组本质上指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与
27、蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识。,5.5.1 双向电泳技术,双向电泳（2-DE）由OFarrells于1975年首次建立并成功地分离约1 000个E.coli蛋白，并表明蛋白质谱不是稳定的，而是随环境而变化。双向电泳原理简明，第一向进行等电聚焦，蛋白质沿pH梯度分离，至各自的等电点；随后，再沿垂直的方向进行分子量的分离。,等电聚焦电泳（IEF）原理：利用特殊的一种缓冲液（两性电解质）在凝胶（常用聚丙烯酰胺凝胶）内制造一个pH梯度，电泳时每种蛋白质就将迁移到等于其等电点（pI）的pH处（此时此蛋白质不再带有净的正或负电荷），形成一个很窄的区带
28、。SDS-PAGE原理：SDS带大量负电荷，蛋白质在SDS凝胶电场中的运动速率和距离完全取决于其相对分子质量而不受其所带电荷的影响，不同相对分子质量的蛋白质将位于凝胶的不同区段而得到分离。,步骤,细胞或组织样品,样品制备,二向凝胶电泳分离蛋白质,显色,计算机辅助分析2D-PAGE图像,对感兴趣的蛋白质酶解,质谱分析,分析蛋白质在细胞与组织中的表达,5.5.2 蛋白质印迹法,分子生物学中最常用的蛋白质技术可能是蛋白质印迹法（Western bloting），又称免疫印迹法（immunobloting）。原理：经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键
29、形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。,延伸：,Southern印迹法（Southern blot）由英国人Edwin Mellor Southern创建。DNA-DNA杂交。Northern 印迹法（Northern blot）：将RNA固定在硝酸纤维素膜上后,用互补的,具有放射性标记的RNA或DNA探针与其杂交。Western印迹法（Western blot）：将蛋
30、白质转移到膜上后，用特异性抗体进行杂交。,5.6.3 蛋白质的质谱分析技术,质谱由于很高的灵敏度、准确性、易操作性、快速性及很好的普适性而倍受科学家的广泛注意。在质谱测序中，灵敏度及准确性随分子量增大有明显降低，所以肽的序列分析比蛋白容易许多，许多研究也都是以肽作为分析对象进行的。近年来随着电喷雾电离质谱(electrosprayionisation，ESI)及基质辅助激光解吸质谱(matrixassistedlaserdesorption/ionization，MALDI)等质谱软电离技术的发展与完善，极性肽分子的分析成为可能，检测限下降到fmol级别，可测定分子量范围则高达100000Da，目前基质辅助的激光解吸电离飞行时间质谱法(MALDITOFMS)已成为测定生物大分子尤其是蛋白质、多肽分子量和一级结构的有效工具，也是当今生命科学领域中重大课题蛋白质组研究所必不可缺的关键技术之一。,
