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1、叶绿体色素的提取及理化性质的鉴定,授课人:廖鹏飞,一、实验目的及要求,掌握提取和分离叶绿体中色素的方法了解叶绿素的物理和化学性质,二、相关知识和实验原理,高等植物体内的叶绿体色素有叶绿素和类胡萝卜素两类，主要包括叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素四种。,表6-1 高等植物体内叶绿体色素的种类、颜色及含量,叶绿素(Chlorophylls)是叶绿酸的酯，它在植物进行光合作用中吸收可见光，并将光能转变为化学能。叶绿素是植物进行光合作用所必需的催化剂。在绿色植物中叶绿素主要以叶绿素a（C55H72O5N4Mg）和叶绿素b（C55H70O6N4Mg）两种结构相似的形式存在，其差别仅是叶绿素a中一个甲
2、基被叶绿素b中的醛基所取代。叶绿素的基本结构见图6-1,在叶绿素分子结构中含有四个吡咯环，它们由四个甲烯基联结成卟啉环，在卟啉环中央有一个镁原子，它以两个共价键和两个配位键与四个吡咯环的氮原子结合成内配盐，形成镁卟啉。在叶绿素分子中还有两个羧基，其中一个与甲醇酯化成COOCH3，另一个与叶绿醇酯化成COOC20H39长链。脂溶性:卟啉环头部呈极性,具亲水性;叶醇尾部具亲脂性,难溶于水,仅溶于酒精、丙酮、已醚、已烷等有机溶剂。,光学特性（1）吸收光谱：色素溶液随波长改变而发生光吸收变化的图谱 Chla Chlb的吸收光谱有二个强吸收峰 640660nm 红光部分 叶绿素特有 410470nm 蓝
3、紫光部分 卟啉环化合物共有（2）荧光和磷光 荧光现象：Chl溶液在透射光下呈绿色，而反射光下呈红色的现象。强度大，寿命短（10-9秒）磷光：Chl溶液停止光照后，仍能在一定时间内放出暗红色的光。寿命长（10-2秒10-3秒）,叶绿素的物理、化学性质,叶绿素a、b，-胡萝卜素和叶黄素 的紫外-可见吸收光谱图,皂化反应Chla、Chlb 是双羧酸的酯 一个羧基被甲基酯化 可发生皂化反应 另一个羧基被叶醇基酯化 COOCH3 C32H30ON4Mg+2KOH COOC20H39 COOK C32H30ON4Mg+CH3OH+C20H39OH COOK,取代反应 卟啉环中的Mg2+可被H+、Cu2+、
4、Zn2+取代，被Cu2+、Zn2+取代后仍保持绿色。用酸处理叶片，H+易进入叶绿体，置换镁原子形成去镁叶绿素，使叶片呈褐色。去镁叶绿素易再与铜离子结合，形成铜代叶绿素，颜色比原来更稳定。人们常根据这一原理用醋酸铜处理来保存绿色植物标本。,类胡萝卜素(Carotenoids)是一类不饱和的四萜类碳氢化合物，胡萝卜素有三种异构体，即-、和 胡萝卜素，其中 胡萝卜素含量最多，也最为重要。胡萝卜素还具有维生素A的生理活性，其结构是由两分子维生素A在端链失去两分子水结合而成。在生物体内，胡萝卜素受酶催化氧化即形成维生素A。叶黄素(3，3-二羟基-胡萝卜素，lutein，C40H56O2)是一种常见的氧化
5、型的类胡萝卜素。胡萝卜素和叶黄素的结构式如图6-2,类胡萝卜素吸收光谱都在蓝紫光部分，所吸收的光能传递给叶绿素用于光合作用，保护叶绿素分子不被氧化或阳光破坏。叶绿素a和b、胡萝卜素、叶黄素都是难溶于水，易溶于丙酮、乙醇、乙醚、石油醚等有机溶剂溶剂。根据它们在有机溶剂中的溶解特性，可将它们从植物叶片中提取出来。,纸色谱法是分离叶绿体色素最简单的方法，它是以滤纸为惰性支持物，滤纸纤维一般能吸收约20%的水分，其中有67%以氢键形式与纤维素上的羟基结合，构成纸色谱的固定相。利用混合色素中各个成分物理、化学性质的差别，在展开过程中，被分离组分在展开剂和固定相之间不断进行分配，并以不同的速度移动，达到相
6、互分离的目的。,四、实验器材,材料与试剂：菠菜、空心菜等绿色植物、脱脂棉等、固体碳酸钠或碳酸钙、石英砂、丙酮、石油醚、蒸馏水、饱和NaCl水溶液、醋酸铜结晶、NaOH-甲醇溶液等。层析液配方：石油醚20ml+丙酮2ml+苯1ml仪器设备：天平、水浴锅、镊子、玻璃漏斗、分液漏斗、研钵、有塞试管、等等。,五、实验方法与步骤,1、叶绿体色素的提取（1）将新鲜绿色植物叶片洗净擦干，去叶柄及中脉，称取 10g 去中脉的叶片，剪碎置研钵内，加入少许固体碳酸钠和10ml乙醇，加少量的石英砂，迅速研磨成匀浆，再加 10ml乙醇充分研磨提取叶绿素。（2）在玻璃漏斗底部垫一滤纸，将匀浆过滤到烧杯中，即为色素提取液
7、。放于暗处备用。,2、纸色谱法分离叶绿体色素(1)取一张层析滤纸，在中心打一个圆形小孔另取一张5-6cm长，2-3cm宽的小条滤纸，将叶绿体色素粗提液用滴管沿长度方向滴在小滤纸条的一边（色素扩散的宽度限制在0.5cm以内），风干，重复4-5次。风干后沿长度方向卷成纸捻。(2)将纸捻的点样端插入滤纸中心的圆形小孔中，使上端与滤纸平齐。立放于培养皿上,培养皿内装有层析液,纸芯的另一端浸入层析液中。(3)盖上皿盖,静置观察。15min左右色素可充分扩展,分离结束，在滤纸上可得到各种色素的同心圆环。,六、叶绿素理化性质的观察,(1)光对叶绿素的破坏作用 在 2支具塞试管中各放入2ml上述色素提取液，盖
8、好塞子。一支试管置暗处，一支试管置强光（如太阳光）下，经23h后，取出2支试管观察溶液颜色有无变化，或在分光光度计上测定663nm处吸光度值后进行比较。(2)叶绿素的荧光 取 2ml上述色素提取液放入一支小试管中，可在窗口与入射光相垂直的方向观察叶绿素暗红色的荧光(3)去镁叶绿素的形成及铜取代作用 取 12ml上述提取液放入试管中，小心加入 3ml 6mol/L HCl，摇动后静止观察溶液颜色变化？然后向再逐步加入醋酸铜结晶少许，把试管在酒精灯下微微加热，观察溶液的颜色有何变化？,（4）黄色素和绿色素的分离：取5ml色素乙醇提取液加到已装有 10ml石油醚的分液漏斗中，摇动分液漏斗，并沿分液漏
9、斗的壁小心加入 15ml蒸馏水，轻轻转动分液漏斗，加入48ml饱和NaCl水溶液，静止几分钟，待分层清楚后，弃去下面的乙醇一水层。再加入 15ml蒸馏水，轻轻晃动分液漏斗，以洗去石油醚中残留的乙醇，弃去水层。然后于色素的石油醚溶液中加入5ml30NaOH甲醇溶液，用力摇动分液漏斗，静止10min，再加蒸馏水8ml，摇动后静置分离，则得到黄色素和绿色色素层，分别保存于试管中。,七、注意事项,1、叶绿体色素对光、温度、氧气环境、酸碱及其它氧化剂都非常敏感。色素的提取和分析一般都要在避光、低温及无酸碱等干扰的情况下进行。2、使用低沸点易挥发有机溶剂要注意实验室安全。实验室要保持良好的通风条件，不得靠近明火操作。3、提取液不宜长期存放，必要时应避光低温保存。,八、讨论,研磨叶片提取叶绿体色素时，加入少量碳酸钠有何作用？加多了会出现什么问题？叶绿素溶液为什么会发荧光？黄色素和绿色素分离的原理？,实验结果部分,1、纸色谱分离色素：要求用铅笔绘制出色素经纸色谱分离后的图形，并用注明各色素环的颜色和名称。2、叶绿素理化性质鉴定：要求写出各个项目的实验现象和并分析其中的原因。见下表,叶绿素理化性质鉴定结果,实验报告格式,一、实验名称 二、实验目的三、实验原理四、主要仪器设备及耗材五、实验步骤与方法六、实验结果七、思考与练习,
