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1、叶绿体色素的提取和分离,基础生物学实验（三）,一、实验目的 1、进一步理解叶绿体色素的提取、分离的原理、方法；2、了解叶绿素的光学特性在光合作用中的意义；,二、实验原理 叶绿体色素是植物吸收太阳光能进行光合作用的重要物质，主要由叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。它们与类囊体膜相结合成为色素蛋白复合体。这两类色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。提取液可用色谱分析的原理加以分离。因吸附剂对不同物质的吸附力不同，当用适当的溶剂推动时，混合物中各种成分在两相（固定相和流动相）间具有不同的分配系数，所以移动速度不同，经过一定时间后，可将各种色素分开。,当叶绿素分子吸收
2、光量子而转变成激发态时，分子很不稳定，当它变回到基态时发射出红光量子，称为萤光现象。叶绿素是一种二羧酸叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯，因而可与碱起皂化作用，产生的盐可溶于水中，利用此法可将叶绿素与类胡萝卜素分开。,叶绿素分子中的镁可被 H+所取代而形成褐色的去镁叶绿素。后者遇铜则形成绿色的铜代叶绿素很稳定，在光下不易被破坏，故常用此法制做标本；叶绿素分子的化学性质也很不稳定，易受强光破坏，特别是当叶绿素与蛋白质分离后，破坏更快。,三、实验材料、试剂与仪器设备（一）实验材料 新鲜植物叶片。（二）试剂 95乙醇（或丙酮）、碳酸钙、石英砂、汽油（纯净无色的）、苯、醋酸铜粉末、50醋酸、氢氧化钾甲醇
3、溶液：20g 氢氧化钾用 100 mL 甲醇溶解，盛在具塞的试剂瓶中、醋酸铜醋酸溶液：用50醋酸100mL溶入醋酸铜6g，时加蒸馏水4倍稀释。（三）仪器设备 天平，剪刀，研钵，漏斗，培养皿一套（底和盖直径相同），蒸发皿，滤纸条（2cm5cm左右），圆形滤纸，蒸发皿，电热吹风机，小烧杯，试管，酒精灯，铁三角架，石棉网，移液管，滴管，玻棒。,四、操作步骤 1、叶绿体色素的提取和荧光现象的观察称取菠菜或其他植物新鲜叶片23g，去掉中脉剪碎，放入研钵中，加入少量石英砂及碳酸钙粉，加5mL95乙醇，研磨成匀浆，再加5mL95乙醇，提取35 min，过滤于试管中，再用3mL95乙醇冲洗残渣。对浓的叶绿体色
4、素提取液观察透射光和反射光的颜色，解释其原因。,2、叶绿体色素的分离(1)取一张圆形滤纸（最好用色层析滤纸剪成圆形）。在滤纸的圆心戳一圆形小孔，另取一张滤纸条（2cm5cm左右，纸条的宽度主要根据培养皿的高度确定）。用滴管吸取浓叶绿素提取液滴在纸条的一边，使色素扩展的宽度限制在0.5cm以内，用电热吹风机吹干后，再重复操作数次，然后将纸沿着长度的方向卷成纸捻，这样浸过叶绿体色素的一边恰在纸捻的一端。(2)将纸捻带有色素的一端插入圆形滤纸的小孔中，与滤纸刚刚平齐（勿突出）。,在培养皿中放蒸发皿，蒸发皿内加入适量汽油和23滴苯，将插有纸捻的圆形滤纸平放在培养皿上，使滤纸的下端（无色素的一端）浸入汽
5、油中，迅速用同一直径的培养皿盖上。此时，叶绿体色素在推动剂的推动下沿着滤纸向四周移动，不久即可看到被分离的各种色素的同心圆环。(4)待汽油将要到达滤纸边缘时，取出滤纸，待汽油挥发后，用铅笔标出各种色素的位置和名称。,3、叶绿体色素的其他理化性质 将本实验步骤1中提取的叶绿体色素溶液用95乙醇稀释一倍，进行以下实验：(1)皂化作用（叶绿素与类胡萝卜素的分离）用移液管吸取叶绿体色素提取液5mL于试管中，加入1.5mL20氢氧化钾甲醇溶液，充分摇匀。片刻后，加入5mL苯，摇匀，再沿试管壁慢慢加入1.5mL蒸馏水，轻轻混匀（不要激烈摇荡），静置在试管架上，可看到溶液逐渐分为两层，下层是稀乙醇的溶液，其
6、中溶有皂化叶绿素a和b,上层是苯溶液，其中溶有胡萝卜素和叶黄素。,(2)H+和Cu2+对叶绿素分子中Mg2+的取代作用 取2支试管，第一支试管加叶绿体色素提取液2mL，作为对照。第二支试管中加叶绿体色素提取液5mL，再加入数滴50醋酸，摇匀，观察溶液的颜色变化。当溶液变褐色后，倒出一半于另一试管中，加入醋酸酮粉末少许，于酒精灯上微微加热，观察溶液的颜色变化，与未加醋酸铜的一半相比较。另取醋酸铜溶液20mL 左右，加入于烧杯中。取新鲜植物叶片2片，放入溶液中，用酒精灯缓缓加热，观察并记录叶片的颜色变化，直至颜色不再变化为止。解释原因。,（3）光对叶绿素的破坏作用 取4支小试管，其中两支各加入5m
7、L 用水研磨的叶片匀浆，另外两支各加入2.5mL叶绿体色素乙醇提取液，并用95乙醇稀释1倍。取1支装有叶绿体色素乙醇提取液的试管和1支装有水研磨叶片匀浆的试管，放在直射光下，另外两支放到暗处，40min后对比观察颜色有何变化，解释其原因。另取本实验中用圆形滤纸层析分离成的色谱一张，通过圆心裁成两半，一半放在直射日光下，另一半放在暗中，半小时后比较两张色谱上的四种色素的颜色各有何变化。,四、注意事项 1、叶绿体色素对光、温度、氧气环境、酸碱及其它氧化剂都非常敏感。色素的提取和分析一般都要在避光、低温及无酸碱等干扰的情况下进行。乙醚使用前应重蒸除去过氧化物。2、使用低沸点易挥发有机溶剂要注意实验室
8、安全。实验室要保持良好的通风条件，不得靠近明火操作。3、提取液不宜长期存放，必要时应抽干冲氮避光低温保存。,五、思考与问题 1、什么是光合作用？2、试讨论叶绿素、-胡萝卜素的生理意义及实际应用。3、绿色植物叶片的主要成分是什么？提取液可能含有哪些化合物？4、一般天然产物的提取方式有哪些？残余的植物组织应如何除去？5、用乙醇-石油醚提取和用丙酮提取可能对结果产生什么影响？,六、注意事项 提取到的叶绿素先观察是否有血红色的荧光，如无荧光或荧光很弱，则表明提取不够完全，残渣加少许丙酮再研磨提取。,七、作业 1、提取叶绿素时为什么要加入少量石英砂及碳酸钙粉，加多了会出现什么问题？2、铜在叶绿素中取代镁的作用，有何实用意义？3、完成此次实验的实验报告。,
