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1、实验十 生防细菌的鉴定及抗菌能力测定,2010.05.11,实验目的,生防细菌的纯化培养生防细菌的分子鉴定生防细菌的抗菌谱及抗菌能力测定,实验原理和步骤,生防细菌的纯化培养抗菌谱的测定准备,粗筛分离得到的生防细菌需要在平板上划线分离，直至分纯出单菌落。,每组包扎培养皿1包（每包不少于6个）,将单菌落生防菌按照图示，在培养基一侧接种成为一条直线，置于30培养备用。,Day 2,生防细菌的液体摇瓶培养抗菌谱的测定,挑取划线分离得到的一个生防菌的单菌落，接种于10mL培养基三角瓶，置于30摇床培养备用。,将待测菌按照图示，在垂直于生防菌培养物一侧分别接种大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌，置于30培
2、养箱备用。,每组准备小包装1.5mL离心管、蓝色白色黄色枪头若干,生防细菌的分子鉴定16SrDNA 是编码原核生物核糖体RNA小亚基16SrRNA 的基因，与细菌整个基因组的变化相比，它具有高度的保守性，其变化的概率与细菌的变异和进化程度是一致的，所以有助于细菌的鉴定和分类。结合完善的数据库，16SrDNA 序列分析可以快速准确的对细菌进行种属鉴定，确定细菌在进化中的位置。16SrDNA 序列包含10个可变区和与之相间的11个恒定区。根据恒定区的保守性可以设计出细菌的通用引物，并且扩增出所有细菌的16SrDNA 片段。可变区因细菌而异，能够揭示生物物种特征核酸序列，是种属鉴定的分子基础。,（二
3、）细菌的16S rRNA分子鉴定反应体系：在一个PCR管中用微量移液枪依次加入：Taq buffer（10）5ul MgCl2 1 ul dNTP 2.5 ul Primer K1+K2 2 ul ddH2O 39 ul用灭菌小枪头挑取单菌落于PCR管中，使菌体悬浮于反应体系中。rTaq（2U/ul）0.5ulPCR反应条件：95预变性5 min后，95变性1 min，55退火1min，72延伸1min，共25个循环，72延伸10min。,抗菌谱结果观察生防菌抗菌能力测定,观察抗菌谱平板。评价生防菌对三种待测菌的拮抗性能。,每组制3块敏感菌的混菌牛膏蛋胨培养基平板。0.1mL的敏感菌菌液；倒入融化好的牛膏蛋胨培养基（不烫手）并轻轻摇晃混匀，冷却为平板。用记号笔将平板划分为4个区域,取1mL生防菌菌液，于1.5mL离心管中。,8000rpm离心5分钟,用灭菌小滤纸片均匀地吸足上清放在敏感菌混菌平板上。,将平板置于30培养箱培养24-48h,观察抑菌圈并测量抑菌圈大小。,结果及讨论,观察抑菌圈的产生，并测量其半径,讨论：如何进行下一步分离提取该生防菌的抑菌物质，并验证该物质为抗菌肽？,
