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1、植物组织培养学实验,宜春学院生命科学与资源环境学院 园林教研室 杨育红园艺教研室 卢其能 却志群,实验一 植物组织培养实验室参观,一、目的要求通过本次实验，使学生掌握如何组建植物组织培养实验室；同时熟悉组培中涉及的各种仪器设备和器皿用具的使用方法。,二、仪器用具 组培室内的各种实验设备。三、实验内容1介绍合理的组培室布局2介绍实验设备和用具3介绍实验的操作规程。四、作业将本此实训内容整理成实验报告。每人设计一个植物组织培养室的组建方案。（说明设计思路）,超净工作台,实验二 MS培养基母液的配制与保存,一、目的要求 通过MS培养基的母液配制和保存,掌握配制和保存培养基母液的基本技能.,二、材料与
2、用具1 所需仪器及设备：天平、烧杯、定容瓶、量筒、蒸馏水、母液瓶、标签、冰箱等。2 所需药品及试剂：配制MS培养基所需的药品、生长调节物质、蒸馏水、95%酒精、0.1mol/l的NaOH、0.1mol/l的HCl,三、方法步骤1母液的配制根据MS培养基配方表配制六种母液。（详见附表）2母液的保存（1）装瓶：将配制好的母液分别倒入瓶中，瓶上贴好标签，注明培养基名称、母液号、吸取量与配制日期。（2）储藏：将母液瓶储放在冰箱内备用。四、作业1整理实验报告。2列一张配制MS培养基母液成分表。,配制MS培养基母液成分表,实验三 MS固体培养基的配制,一 目的要求 通过 MS固体培养基的配制，掌握配制培养
3、基的基本技能。,二 材料与用具,1 所需仪器及设备：电炉、酸度计、高压湿热灭菌器2 所需药品及试剂：配制MS培养基的各种母液、生长调节物质母液、0.1mol/l NaOH、0.1mol/l Hcl、琼脂、蔗糖、蒸馏水3 其他材料：移液管、量筒、定容瓶、培养瓶、标签、铅笔。,三 方法步骤,1按母液顺序和规定量，用吸管提取母液，放入盛有一定量蒸馏水的量筒母液一 20ml 母液二 10ml 母液三 10ml母液四 10ml 母液五 20ml 母液六 5ml 2加入生长调节物质：适配制的培养基而定。3加入蔗糖：30g/l 4加蒸馏水定容后倒入锅中 5加入琼脂：6.5g/l（视琼脂质量而定）,后调节PH
4、值(用1mol/l的NaOH或1mol/l的HCL)6.熔化琼脂:在电炉上加热溶液,并不断搅拌,使琼脂熔化.7.培养基的分装,四、作业,1整理实验报告注：（1）配制培养基时母液吸取量的计算：吸取量（ml）=（培养基中某成分的规定浓度（mg/l）*配制培养基的体积（l）/母液中某成分浓度（mg/l）（2）植物激素母液吸取量计算：吸取母液量（ml）=（培养基中激素浓度（mg/l）*配制培养基体积（l）/激素母液浓度（mg/ml）,实验四 愈伤组织的诱导,一、目的要求 本次试验，首先通过在无菌操作台上进行无菌操作训练，使学生初步掌握组织培养的无菌操作技术。其次，通过本次实验是了解并掌握愈伤组织诱导的
5、基本程序和方法。,二 材料与用具,1 所需仪器及工具：超净工作台、70%酒精、95%酒精、接种器械（主要指剪刀、镊子等）、培养材料或外植体、0.1%的升汞、无菌水等。2 愈伤组织诱导培养基：MS+2.4-D1.0+KT0.2 或B5+2.4-D1.0+KT0.2,三、方法步骤,1进入实验室后用水和肥皂洗净双手，穿上灭菌过的专用实验服、帽子、鞋子。2打开超净工作台内的吹风和紫外灯，并打开无菌操作室内的紫外灯，照射20分钟（进行紫外灭菌）3进行外植体预处理（即对植物组织进行修整，去掉不需要的部分，将准备使用的植物材料在流水中冲洗干净。）4照射20分钟后，关闭紫外灯，打开照明灯，用70%的酒精擦拭工
6、作台和双手，准备进行外植体的消毒和接种工作。,5用蘸有70%的酒精的纱布擦拭装有培养基的培养瓶，放进工作台。6把接种器械浸泡在95%酒精中，在火焰上灭菌后，放在器械架上。7胡萝卜种子经75%乙醇浸泡30s，无菌水冲洗2遍，再用0.1%升汞浸泡10分钟，无菌水冲洗3-5次后，接种于不含任何激素的1/2MS固体培养基含（1.5%蔗糖）上，于24暗培养条件下萌发7-10天后，将子叶和下胚轴切成0.5cm的截段作为组织培养的材料。8.进行接种。9.接种完毕后,清理和关闭超净工作台,并将培养瓶放入培养室培养。,四、作业,1.整理实验报告。2.接种一周后,观察接种材料的污染情况,并分析污染原因。3.25天
7、后统计愈伤组织的诱导率，记录实验现象。,实验五 月季茎段的离体培养,一、目的要求 通过本次试验，熟练掌握外植体的表面灭菌方法，并巩固掌握无菌操作的基本要领，重点掌握一般花卉的器官的离体培养的基本程序。,二 材料与用具,1 所需仪器及工具：超净工作台、70%酒精、95%酒精、接种器械（主要指剪刀、镊子等）、培养材料或外植体、0.1%的升汞、无菌水等。2 所需材料：嫩叶、嫩茎切段、顶芽或侧芽3 诱导培养基：MS+2.4-D1.0mg/l+6-BA0.1mg/l或,三、方法步骤,1进入实验室后用水和肥皂洗净双手，穿上灭菌过的专用实验服、帽子、鞋子。2打开超净工作台内的吹风和紫外灯，并打开无菌操作室内
8、的紫外灯，照射20分钟（进行紫外灭菌）3进行外植体预处理（即对植物组织进行修整，去掉不需要的部分，将准备使用的植物材料在流水中冲洗干净。）4照射20分钟后，关闭紫外灯，打开照明灯，用70%的酒精擦拭工作台和双手，准备进行外植体的消毒和接种工作。,5 外植体消毒灭菌时，先用自来水冲洗2小时，洗去渗出汁液，再用70%的酒精消毒8-9秒后用0.1%的升汞消毒7-8分钟，无菌水冲洗4-5次，效果较好.接种时，用干净滤纸吸干外植体表面水分，可以明显减少污染率和褐变率 6 接种完毕后,清理和关闭超净工作台,并将培养瓶放入培养室培养。,四、作业,1.整理实验报告。2.接种一周后,观察接种材料的污染情况,并分
9、析污染原因。3.25天后统计茎段分化率，记录实验现象。,实验六 花药培养,一、目的要求 花药培养可应用于品种育种，即单倍体育种。同时，有的植物花药培养还能有效脱除母株所带病毒，获得无病毒苗。通过本实验，学习花药培养技术，为今后应用这一技术奠定基础。,二、材料与用具,1.材料：草莓花蕾2.仪器：光学显微镜、盖玻片、载玻片、超净工作台、手术剪、接种环、枪状镊子、高压灭菌器、电磁炉、培养瓶等。3.试剂：70%-75%乙醇、0.1%升汞、无菌水、醋酸洋红醋酸洋红的配制：将100ml 45%的冰醋酸红置锥形瓶中煮沸，徐徐加入0.5-1g洋红粉末（不要一次加入，以免溅沸）。继续煮沸20min（可采用回流煮
10、沸），冷却备用。,三、方法步骤,1.培养基配制诱导培养基：MS+6-BA0.5mg/l+KT0.1mg/l+NAA2.0mg/l分化培养基：MS+6-BA0.5mg/l+ZT2.0mg/l+NAA0.2mg/l,2.材料的选择（即花粉发育时期的鉴定）选择花粉处于单核靠边起的花药培养鉴定方法：从田间采集花蕾数个，从每花蕾取花药1-2枚置载玻片上，加醋酸洋红1-2滴，用玻棒头或镊子的一头压碎花药，剔除碎片，加盖玻片镜鉴。通过镜鉴记录处于单核靠边期花药花蕾的外观形态，便于下次采集。通常花药单核靠边期的草莓花蕾形态是：未开放，花萼略长于花冠或花冠刚露白，花冠白色或淡绿且不松动，花药微黄且充实。,3.材
11、料预处理、消毒和接种,取花粉发育处于单核靠边期(约4-6mm大小)的花蕾，放在4冰箱中低温预处理3d-5d或不经低温处理，用70%的乙醇表面消毒10-15s后，再经2%的84消毒液消毒15min，无菌水清洗3-4次，每次4-5min，用无菌试纸吸干花蕾表面水分后，在超净工作台上剥取花药，立即接种于诱导培养基上。,4.培养观察接种后暗培养7天，再转入光照培养。组培室内温度控制在20左右，光照时间16h/d，光强1500-2000lx。,四 分析讨论1 观察并记录花药的分化状况2 30天后，分析培养基对于花药培养的影响,实验七 植物顶端分生组织培养脱毒,一、目的要求 通过本次实验，了解一般园林植物
12、的组织培养脱毒技术，并掌握顶端分生组织的分解方法,二、材料与用具,1.材料：草莓茎尖2.仪器：光学显微镜、超净工作台、手术剪、接种环、枪状镊子、高压灭菌器、电磁炉、培养瓶等。3.试剂：70%-75%乙醇、0.1%升汞、无菌水,三、方法步骤,1.培养基配制诱导培养基：MS+6-BA0.5mg/l+KT0.1mg/l+NAA2.0mg/l分化培养基：MS+6-BA0.5mg/l+ZT2.0mg/l+NAA0.2mg/l,2打开超净工作台内的吹风和紫外灯，并打开无菌操作室内的紫外灯，照射20分钟（进行紫外灭菌）3进行外植体预处理（即对植物组织进行修整，去掉不需要的部分，将准备使用的植物材料在流水中冲洗干净。）4照射20分钟后，关闭紫外灯，打开照明灯，用70%的酒精擦拭工作台和双手，准备进行外植体的消毒和接种工作。,5 将草莓茎尖置于显微镜下，用镊子夹住茎段的后半部分，并用解刨针除去叶片及叶片原基，直至露出闪亮圆锥体，即为顶端分生组织。6 用消毒完毕的解剖刀，切下顶端分生组织，并迅速将其转接到培养基上。7 接种后暗培养7天，再转入光照培养。,四 分析讨论,1 观察并记录培养材料得生长状况。2 分析培养基对顶端分生组织生长和分化的影响。,
