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1、RuBPCase活性测定技术,1,5-二磷酸核酮糖羧化酶（E.C.4.1.1.39）14C放射性同位素示踪法,目 录,Rubisco的发现和催化反应Rubisco 的亚基组成Rubisco的体内外活化Rubisco的活性测定方法放射性同位素的使用和注意事项,1.Rubisco的发现和催化反应,1950s Wildman SG Fraction I protein 1954 Calvin RuBPCase purified 1968 Kawashima Fraction I protein crystallization Fraction I protein=RuBPCase 1970s RuB
2、POase found Nature、Science上文章认为它是光合作用的限速酶，甚至是产量的限速酶！,RuBPCase催化反应,以上两个反应为竞争性反应,：特征因子受酶一级序列和构象影响,(8ruc active site),特征因子,特征因子越大，利用低CO2的能力越强；对于C3植物有重要意义；生物越低等，特征因子越小；一般高等植物的特征因子50100，目前自然界发现最高的为海洋红藻的Rubisco，特征因子为210左右；Vmax同很难兼得。,低效率的酶,Turnover number 转换数 CAT:10000 RuBPCase:34 Site-directed mutation Sp
3、reizter等试图分子改造,2.Rubisco的亚基组成,Form I:L8S8 高等植物 Form II:(L2)n 光合细菌 Form III:古核生物 LSU叶绿体编码；SSU细胞核编码；自然界最丰富的蛋白质 Rubisco在叶绿体中含量达到300mg/ml,3.Rubisco的体内外活化,active form inactive form in vitro activation 用于活化的CO2不同于参与反应的CO2 Mg2+：20mM ACO2:10mM(NaHCO3),植物体内无法实现！,初始活性 initial activity 总活性 total activity 活化率,i
4、n vivo activation 1980s 拟南芥突变体 只在5 CO2生存 dif-2D电泳发现：突变体少47、50kDa两条蛋白带 鉴定为Rubisco activase RuBPCase体内活化由该酶负责！,白天activase利用光合作用“光反应”制造的ATP活化Rubisco；activase不耐高温，对于C4植物是光合作用的重要限速酶。,4.Rubisco的活性测定方法,酶活性的定义 RuBPCase活性常用测定方法偶联酶方法14C放射性同位素方法 测定单位时间内产物14PGA的增加。通过供给14C标记的底物CO2实现。,放射性底物14CO2通过NaH14CO3提供；RuBPC
5、ase预先体外活化；反应在30C下进行；未反应的14CO2用挥发性强酸HCl释放到大气中；最后留在闪烁瓶中的放射性完全来自14PGA；放射性强度用液体闪烁计数器测定。,试剂,研磨介质：pH7.7缓冲液为主；固定介质：100mM HEPES,20mM KCl,80mM MgCl2,12mM NaHCO3,1mM DTT NaH14CO3溶液；RuBP溶液；中止液：4N HCl 闪烁液,步骤,粗酶液的制备 称取0.2g左右的绿色功能叶片，加入2ml研磨介质研磨匀浆，再用2ml冲洗研钵，一起离心（10000 x g），取上清用小量筒测定体积，冰浴上待用。,步骤,初始活性的测定 1）往闪烁瓶中加入50
6、0l固定介质，放到水浴锅中保温；2）用微量进样器吸取10 l RuBP溶液加入到闪烁瓶中；3）用专用的微量进样器取10 l NaH14CO3溶液加入到闪烁瓶中；4）保温5min；5）加入100 l粗酶液启动反应，并开始计时；6）45s时加入500 l 中止液停止反应；7）烘干；。,步骤,总活性的测定 1）往闪烁瓶中加入500l固定介质，放到水浴锅中保温；2）加入100 l粗酶液；3）保温5min；4）用专用的微量进样器取10 l NaH14CO3溶液加入到闪烁瓶中；5）用微量进样器吸取10 l RuBP溶液加入到闪烁瓶中启动反应，并开始计时；6）45s时加入500 l 中止液停止反应；7）烘干
7、；。,活性计算,Dpmck：本底对照（不加粗酶液）比强：dpm/mol CO2t：反应时间，45sactivity单位：mol min-1 g-1 FW,5.放射性同位素的使用和注意事项,14C安全性 优点：软射线，穿透能力弱，无需昂贵防护措施，操作安全性较高；缺点：物理半衰期5000多年，反应废料难处理。,规范性 在指定地点进行指定同位素种类的操作，完成后立即清理现场，并用专门仪器检查有无污染。许可制度 只有经过专门培训后才能操作同位素。,思考题,一次测定RuBPCase活性中，取叶片0.2g，研磨离心后收集上清液得1.2ml，从中取10l样品测定活性。测得本底放射性为100dpm，初始活性为2100dpm，总活性为3100dpm，比强为3x105 dpm/mol CO2。请计算出该样品的初始活性、总活性（mol min-1 g-1 FW）以及活化率（%）。,仪器和设备,玻璃微量进样器 50ul 2支移液器1ml 3支移液器100ul 1支移液器500ul 1支研钵 1个/组小量筒10ml 1个/组水浴锅（温度计）离心管（5 or 7ml）白陶瓷盘 2个一次性手套 4包枪头（100ul和1ml）白大褂 2件,
