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1、第十六章蛋白质的生物合成,导 学,1、掌握遗传密码的基本规律2、掌握蛋白质合成的体系。3、掌握蛋白质生物合成的基本过程。4、掌握蛋白质合成后加工的主要方式。了解蛋白质合成后的输送。,16.1 遗传密码16.2 蛋白质合成体系16.3 蛋白质的合成过程16.4 蛋白质合成后的加工修饰16.5 蛋白质的定向运输,将mRNA分子中由碱基序列组成的遗传信息，通过遗传密码破译的方式转变成为蛋白质中的氨基酸排列顺序，因而称为翻译（translation)。,从RNA到蛋白质,16.1 遗传密码,密码子（codon）：mRNA中的核苷酸序列与多肽链中氨基酸序列之间的对应关系。mRNA上每三个连续核苷酸对应一
2、个氨基酸，这三个连续的核苷酸就称为一个密码子，或三联体密码（triplet codons）。,16.1.1 遗传密码和密码单位,苯丙氨酸,组氨酸,苏氨酸,遗传密码（genetic codon)：密码子的总和。mRNA4种碱基 1个碱基作为密码4个密码子（41）2个碱基作为密码16个密码子（42）3个碱基作为密码64个密码子（43）64个密码子：其中61个代表20种氨基酸，3个代表终止密码子。,保温,蛋白质合成停止,poly U，ATP，GTP，氨基酸,多聚苯丙氨酸（UUU是Phe的密码子）,同样方法证明：CCC是Pro的密码子，AAA是Lys的密码子.,提取液（DNA、mRNA、tRNA、核糖
3、体、酶等）,遗传密码的破译,1968年诺贝尔生理医学奖,遗传密码字表,起始密码（start codon）：AUG（编码甲硫氨酸、甲酰甲硫氨酸），少数情况 GUG；终止密码（stop codon）：无义密码子(nonsense codons)，不编码氨基酸的密码子，它们单个或串联在一起用于多肽链翻译的结束，没有相应的tRNA存在，有UAA、UAG、UGA。同义密码（synonymous codon）：编码相同氨基酸的不同密码子。,遗传密码的基本特征方向性连续性不重叠性简并性摆动性通用性,重叠密码,非重叠连续的密码,不连续的密码,方向性(directional)：53，AUG。连续性（contin
4、uity）不重叠性（nonoverlapping）,基因损伤引起mRNA阅读框架内的碱基发生插入或缺失，可能导致移码突变。,简并性（degeneracy）：多个密码子编码同一种氨基酸的现象。在遗传密码中，除色氨酸和甲硫氨酸仅有一个密码子外，其余氨基酸有24个或多至6个密码子。,密码的简并性往往表现在密码子的第三位碱基上。密码的偏爱性：在不同生物中使用同义密码子的频率是不相同的。意义：减少有害突变，维持物种稳定。,摆动性（wobble）tRNA上反密码子的第1位碱基与mRNA密码子的第3位碱基配对时，并不严格遵循碱基配对规律，可以在一定范围内变动的现象，又称变偶性。其它两个碱基要严格配对。,密码
5、子的表示法：,密码子的专一性基本取决于前两位碱基，第三位碱基起的作用有限（有较大灵活性）。,通用性（universal）：指各种低等和高等生物，包括病毒、细菌及真核生物基本上共用一套遗传密码。密码的变异性：目前已知线粒体DNA(mtDNA)和叶绿体的编码方式与通用遗传密码子有所不同，如在一些线粒体中UGA不是终止密码子，而是色氨酸的密码子。密码的通用性进一步证明各种生物进化自同一祖先。,密码的防错系统：密码子的碱基顺序与其相应AA的物理化学性质之间存在巧妙的关系。中间是U，AA是非极性、疏水性的；中间是C，AA是非极性的或具有不带电荷的极性侧链；中间是A或G，AA是亲水性的；第一位是A或G，第
6、二位是A或G，AA具有可解离的亲水侧链并具碱性；前二位是AG，AA具酸性亲水侧链。,16.1.2 阅读框,一个蛋白质的氨基酸序列是由连续的三联体密码子的线性顺序决定的，这个序列的第一个密码子建立了一种阅读框（reading frame)。从mRNA 5端起始密码子AUG到3端终止密码子之间的核苷酸序列，称为开放阅读框架(open reading frame，ORF)。,16.2 蛋白质合成体系,20种氨基酸作为原料 酶及蛋白因子，如IF、eIF、EF、RF等 ATP、GTP、无机离子,参与蛋白质生物合成的物质包括：,三种RNA mRNA rRNA（核糖体）tRNA,翻译的直接模板。mRNA是遗
7、传信息的携带者。编码序列(codon sequence，CDS)：一条多肽链对应的mRNA序列，即位于起始密码子和终止密码子之间的核苷酸序列。,16.2.1 mRNA,5CTGTCATAAAGATGTCACGGCCGAGACTTATAGTCGCT.CATGAAAGCCGCTCTGGGGCTGAAATAAAACCGCGCCCGG3,原核生物mRNAS-D序列：mRNA起始密码AUG上游约813个核苷酸处，有49个核苷酸组成的富含嘌呤的一段序列，以AGGA为核心，因发现者是Shine-Dalgamo而得名为S-D序列，又称为核糖体结合位点（ribosomal binding site，RBS）。,
8、真核生物mRNA,帽子结构：结合核糖体，增加稳定性；poly(A)尾：增加稳定性，提高翻译效率。,16.2.2 核糖体（ribosome）,由rRNA和多种蛋白质结合而成的一种较大的核糖核蛋白颗粒（核糖体），是蛋白质生物合成的场所（装置）。,核糖体的功能部位,A位：氨酰-tRNA结合位点（aminoacyl-tRNA binding site，受位）；P位：肽酰基-tRNA结合位点（peptidyl-tRNA binding site，给位）；E位：空位(exit site)，专供tRNA离开（真核生物没有）；mRNA结合位点：核糖体小亚基；,P位和A位紧密连接，各占一个密码子的距离。,转肽酶
9、部位：形成肽键，位于核糖体大亚基。,核糖体在细胞内的存在形态：核糖体亚基、单核糖体和多核糖体。多核糖体：一定数目的单个核糖体与一个mRNA分子结合而成的念珠状结构；大约每隔40个核苷酸结合一个核糖体。每个核糖体独立完成一条肽链的合成，在多核糖体上可同时进行多条肽链的合成，提高翻译效率。,16.2.3 tRNA,氨基酸的搬运工具，tRNA在翻译过程中起接合体（adaptor）作用。,tRNA的关键部位：3端CCA接受氨基酸，形成氨酰-tRNA；反密码子部位与mRNA结合（tRNA接头作用）；氨酰tRNA合成酶的识别位点；核糖体识别位点。翻译精确性的保证：密码子-反密码子-氨基酸,tRNA的表示方
10、法：,tRNA的种类起始tRNA：真核生物tRNAMet，原核生物tRNAfMet（N-甲酰甲硫氨酰tRNA）。同工tRNA：携带相同氨基酸而反密码子不同的一组tRNA。校正tRNA：生物体发生突变后，校正机制之一是通过校正基因合成一类tRNA，经过其反密码子上发生某种突变，以“代偿”或校正原有突变所产生的不良后果，以维持翻译作用译码的相对正确性，从而翻译出正常蛋白质，这类tRNA称为校正tRNA。可有多种校正tRNA携带同一种氨基酸。,16.2.4 氨酰-tRNA合成酶（aminoacyl-tRNA synthetase）,共分两步反应。,反应机理,消耗两个高能键PPi,氨基酸活化部位为-羧
11、基；氨基酸与tRNA连接方式为酯键，为高能键。,-羧基,tRNA与酶的结合模型,氨酰-tRNA合成酶的特点专一性对氨基酸有极高的专一性，每种氨基酸都有专一的酶；只作用于L-氨基酸，不作用于D-氨基酸；消耗2个高能磷酸键。（20种氨酰-tRNA合成酶）对tRNA 具有极高专一性（第二遗传密码系统），能识别与此氨基酸相对应的一个或多个tRNA 分子。校对作用：氨酰-tRNA合成酶的水解部位可以水解错误活化的氨基酸。翻译过程的错误频率10-4。,氨基酸的活化形式：氨基酰tRNA氨基酸的活化部位：羧基氨基酸与tRNA连接方式：酯键氨基酸活化耗能：2个Pi,起始氨基酰-tRNA,真核生物：Met-tRN
12、AiMet（i-initiation）原核生物：fMet-tRNAifMet,Met-tRNAfMet甲硫氨酰-tRNA,fMet-tRNAfMetN-甲酰-甲硫氨酰-tRNA,甲酰四氢叶酸,20种氨基酸作为原料 酶及蛋白因子，如IF、eIF、EF、RF等 ATP、GTP、无机离子,参与蛋白质生物合成的物质包括：,三种RNA mRNA rRNA（核糖体）tRNA（氨酰-tRNA合成酶）,16.3 蛋白质的合成过程,方向：mRNA模板的方向：5 3；蛋白质的合成方向：N端 C端；,翻译过程从阅读框架的5-AUG开始，按mRNA模板三联体密码的顺序延长肽链，直至终止密码出现。,翻译的起始(init
13、iation)翻译的延长(elongation)翻译的终止(termination),整个翻译过程可分为：,16.3.1 翻译的起始(initiation),指mRNA和起始氨酰-tRNA分别与核糖体结合而形成翻译起始复合物(translational initiation complex)。,起始氨酰-tRNA,真核生物：Met-tRNAiMet原核生物：fMet-tRNAifMet,参与起始过程的蛋白质因子称起始因子（initiation factor，IF）。,原核生物的起始因子：IF1、IF2和IF3。IF-1：占据A位防止结合其他tRNA。IF-2：促进fMet-tRNAi与小亚基结
14、合。IF-3：促进大小亚基分离，提高P位对结合起始tRNA敏感性。,真核生物各种起始因子的生物功能（eukaryotic initiation factor，eIF）,16.3.1.1 原核生物翻译起始复合物形成,1、核糖体大小亚基分离；2、mRNA在小亚基定位结合；3、起始氨基酰-tRNA的结合；4、核糖体大亚基结合。,IF-3,IF-1,1、核糖体大小亚基分离,IF-3,IF-1,2、mRNA在小亚基定位结合,mRNA的S-D序列,IF-3,IF-1,3、起始氨基酰tRNA与小亚基结合,fMet-tRNAifMet是唯一一个结合到P位的氨酰-tRNA，其他的都是先与A位结合。,IF-3,I
15、F-1,IF-2,GTP,GDP,Pi,4、核糖体大亚基结合,IF-3,IF-1,IF-2,-GTP,GDP,Pi,起始过程消耗1个GTP。,16.3.1.2 真核生物翻译起始复合物形成,基本过程同原核生物翻译的起始过程，也分4个步骤。,1、核糖体大小亚基分离；2、mRNA在小亚基定位结合；3、起始氨基酰-tRNA的结合；4、核糖体大亚基结合。,真核生物翻译起始复合物形成过程,核糖体是80S；起始因子种类多；起始tRNA的Met不需甲酰化；mRNA的5帽子和3poly A尾结构与mRNA在核糖体就位有关；起始tRNA先与核糖体小亚基结合，然后mRNA再结合上来。,真核生物翻译起始的特点,16.
16、3.2 翻译的延长(elongation),指按照mRNA密码序列的指导，依次添加氨基酸从N端向C端延伸肽链，直到合成终止的过程。,肽链的延长是在核糖体上连续性循环式进行，又称为核糖体循环（ribosomal cycle)，每次循环增加一个氨基酸，分为以下三步：1、进位（entrance）2、成肽（peptide bond formation）3、转位（translocation）,肽链合成的延长因子,1、进位,指根据mRNA下一组遗传密码指导，使相应氨基酰-tRNA进入核糖体A位。,延长因子EF-T催化进位（原核生物）,消耗1个GTP,Tu,Ts,GTP,GDP,Tu,Ts,GTP,2、成肽
17、,由转肽酶（transpeptidase）催化的肽键形成过程。,3、转位,延长因子EF-G有转位酶（translocase）活性，促进核糖体向mRNA的3侧移动。,消耗1个GTP,fMet,fMet,重复进行，直至肽链延长到一定长度为止。,进位,成肽,转位,真核生物肽链合成的延长过程与原核基本相似，但有不同的反应体系和延长因子。另外，真核细胞核糖体没有E位，转位时卸载的tRNA直接从P位脱落。,真核生物延长过程,16.3.3 翻译的终止(termination),当mRNA上终止密码出现后，多肽链合成停止，肽链从肽酰-tRNA中释出，mRNA、核糖体等分离，这些过程称为肽链合成终止。,释放因子
18、（release factor，RF）终止相关的蛋白因子。,识别终止密码，如RF-1特异识别UAA、UAG；而RF-2可识别UAA、UGA；诱导转肽酶改变为酯酶活性，相当于催化肽酰基转移到水分子-OH上，使肽链从核糖体上释放。,释放因子的功能,原核生物释放因子：RF-1，RF-2，RF-3；真核生物释放因子：eRF,原核肽链合成终止过程,GTP,GTP,GDP,消耗1个GTP,RF,生成氨酰-tRNA：1个 ATP(2个Pi)起始：1个 GTP延长：2个 GTP终止：1个 GTP 结论：每合成一个肽键至少消耗4个P。,原核生物蛋白质合成的能量计算,起始复合物形成所参与的因子不同原核：IF1、I
19、F2、IF3、70S核糖体；真核：9种起始因子参与 eIF1，eIF2，eIF3，EIF4（a、b、c、d、e、f）eIF5，eEIF6 和 80S核糖体。起始复合物形成的次序差异原核：30S+mRNA+fMet-tRNAifMet+50S，最终形成70S起始复合物；真核：40S+Met-tRNAiMet+mRNA+60S，最终形成80S起始复合物。,真核生物与原核生物蛋白质合成的差异,延长和终止的差异过程基本相似，但参与因子不同；原核：EF-Tu、EF-Ts、EF-G；RF1、RF2、RF3。真核：EF1、EF1、EF2；RF。起始氨基酸：fMet、Met合成速度：原核快，10-15个肽键/
20、核糖体/秒；真核慢，1-3个肽键/核糖体/秒。,16.3.4 蛋白质生物合成的抑制剂,四环素族,16.4 蛋白质合成后的加工修饰,肽链从核糖体释放后，经过细胞内各种加工修饰处理，成为有活性的成熟蛋白质的过程。,16.4.1 蛋白质前体的加工,一级结构的加工修饰氨基端和羧基端的修饰：N端甲酰甲硫氨酸的甲酰基经酶水解而除去；某些蛋白质分子氨基端要进行乙酰化，羧基端也要进行修饰。二硫键的形成：真核细胞合成的某些蛋白质，往往能自发地折叠形成其天然构像，分子内的半胱氨酸的巯基之间形成共价键（二硫键）。二硫键在稳定蛋白质空间构型中起着重要作用。,蛋白质自我剪接：切除蛋白内含肽的过程。,氨基酸的修饰：磷酸化
21、修饰：某些蛋白质分子中的丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸残基在酶催化下被ATP磷酸化；糖基化修饰：糖蛋白的糖链是蛋白质合成之后，在通过高尔基体时，经过糖化而形成的；羟基化反应：胶原蛋白中的脯氨酸与赖氨酸的羟基化，由相应的羟基化酶催化完成；甲基化反应：某些蛋白质中的赖氨酸残基需要甲基化，某些谷氨酸残基的羧基也要甲基化，以除去负电荷。,高级结构的修饰：亚基聚合；辅基连接；疏水脂链的共价连接等。,16.4.2 蛋白质的折叠,蛋白质折叠过程中存在中间体,大多数蛋白质的折叠都需要其他酶和蛋白质的辅助。,新生肽链的体内折叠,合成后折叠,边合成边折叠,几种有促进蛋白折叠功能的大分子,1、分子伴侣(molecular
22、chaperon)2、蛋白二硫键异构酶(protein disulfide isomerase,PDI)3、肽-脯氨酰顺反异构酶(peptide prolyl cis-trans isomerase,PPI),1、分子伴侣(molecular chaperon)：细胞内一类保守蛋白质，可识别肽链的非天然构象，促进各功能结构域和整体蛋白质的正确折叠。,热休克蛋白(heat shock protein,HSP)：HSP70、HSP40和GreE家族；伴侣素(chaperonins)：包括 GroEL/GroES家族，为非自发性折叠蛋白质提供能折叠形成天然空间构象的微环境。,热休克蛋白促进蛋白质折叠
23、的基本作用：与待折叠的多肽链结合，诱发多肽链折叠成正确构象，防止多肽链间相互聚合或错误折叠。,HSP40结合待折叠多肽片段,HSP70-ATP复合物,HSP40-HSP70-ADP-多肽复合物,ATP水解,GrpE,ATP,ADP,复合物解离，释出多肽链片段进行正确折叠,伴侣素的主要作用:为非自发性折叠蛋白质提供能折叠形成天然空间构象的微环境。,伴侣素GroEL/GroES系统促进蛋白质折叠过程,2、蛋白二硫键异构酶(protein disulfide isomerase,PDI)二硫键异构酶在内质网腔活性很高，可在较大区段肽链中催化错配二硫键断裂并形成正确二硫键连接，最终使蛋白质形成热力学最
24、稳定的天然构象。,3、肽-脯氨酰顺反异构酶(peptide prolyl cis-trans isomerase,PPI),多肽链中肽酰-脯氨酸间形成的肽键有顺反两种异构体，空间构象明显差别。,肽酰-脯氨酰顺反异构酶可促进上述顺反两种异构体之间的转换。,肽酰-脯氨酰顺反异构酶是蛋白质三维构象形成的限速酶，在肽链合成需形成顺式构型时，可使多肽在各脯氨酸弯折处形成准确折叠。,16.5 蛋白质的定向运输,靶向输送（protein targeting）,蛋白质在合成以后，定向到达其执行功能的目标地点的过程。,所有靶向输送的蛋白质结构中存在分选信号，主要为N末端特异氨基酸序列，可引导蛋白质转移到细胞的适
25、当靶部位，这一序列称为信号序列。,信号序列(signal sequence),靶向输送蛋白的信号序列或成分,细胞内蛋白质的运输方式,穿膜运输：细胞质基质-细胞器，分选信号-细胞器膜上相应转运子；门控运输：细胞质基质-细胞核，分选信号-核孔复合体上相应受体；小泡运输：细胞器-细胞器（细胞膜），分选信号-运输小泡膜上相应受体。,16.5.1 分泌蛋白的靶向输送,真核细胞分泌蛋白等前体合成后靶向输送过程首先要进入内质网，再分别被包装成分泌小泡而分泌出细胞。,信号肽（signal peptide）：各种新生分泌蛋白的N端有保守的氨基酸序列。信号斑（plaque signal）：位于多肽链不同部位的几个
26、特定氨基酸序列经折叠后形成的斑块区，具有分选信号的功能。信号斑是一种三维结构；完成分选任务后仍然存在。,信号肽的一级结构,N端侧碱性区,疏水核心区,C端加工区,可溶性蛋白质到内质网腔的运输过程,信号肽引导多肽链通过内质网膜上蛋白质转运子进入内质网，转运子的中央孔与核糖体大亚基的中央通道对齐，供多肽链穿入。,信号肽指导真核蛋白进入内质网,SPR（signal recognition particle）：信号识别蛋白,信号肽引导真核分泌蛋白进入内质网,翻译-运转同步,16.5.2 线粒体蛋白的靶向输送,前体蛋白和细胞器膜上的受体识别，通过蛋白通道进入线粒体（叶绿体和过氧化物酶体等类似），在线粒体中去除前导肽（信号肽）序列，在分子伴侣的帮助下形成空间结构。,翻译后运转,16.5.3 细胞核蛋白的靶向输送,在核定位顺序（NLS）的帮助下进入细胞核,翻译后运转,门控运输,遗传密码：概念、起始密码和终止密码、遗传密码的特点。参与蛋白质生物合成的物质：核糖体、mRNA和tRNA的结构特点和功能、氨酰-tRNA合成酶的特点、蛋白因子的作用。蛋白质生物合成的过程：蛋白质合成的过程及其忠实性、真核生物与原核生物蛋白质合成的差异、合成过程的能量变化。翻译后的加工修饰和定向运输：加工修饰类型、定向运输的相关概念。,
