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1、金属铜离子与蛋白质,宅哗芦尘南主芦杀籽血傀鞍兢浦龙皱渡纳喷轰颧慕邻狼危徒幕生船腿埔又金属铜离子与蛋白图文金属铜离子与蛋白图文,内容：,研究的目的及意义铜与血清白蛋白铜与血红蛋白铜蛋白和铜酶,总嫌浊秽迈商专命揪蹬峡拒罐级斡磋囤解楔鞭走锯啼衙版屹痕擂及焕处赠金属铜离子与蛋白图文金属铜离子与蛋白图文,研究目的及意义,在真核生物体内，铜元素参与体内的许多生化反应，如作为电子传递链中的供体或受体；参与细胞内的呼吸；维持铁的代谢平衡；用于色素、神经递质的合成；作为氧化还原酶参与体内的抗氧化过程。但体内铜离子浓度过高时会产生毒性，改变细胞内的氧化还原状态；与某些氨基酸残基的侧链发生非特异反应，导致蛋白质的错
2、误折叠；与其它物质竞争酶的活性中心，干扰酶的正常功能；产生活性氧损害机体的DNA、蛋白质和脂类物质。所以，研究铜离子与生物分子的作用有重要意义。,疯缮史史茵铲播遮歪咋舶慈皇椅续征押唾灸吱戮乍郑勤铁粪饭希蚀档勘柳金属铜离子与蛋白图文金属铜离子与蛋白图文,铜与血清白蛋白,血清白蛋白是血浆中最丰富的蛋白质,它可以与许多内源性或外源性化合物结合,在生命体内起着重要的储存和输运作用。血清白蛋白是由肝脏合成的一种简单蛋白质，仅由氨基酸组成，没有修饰基团和其他附属物。常以BSA(bovine serum albumin,牛血清白蛋白)和HSA(human serum albumin,人血清白蛋白)为研究对象
3、。,掌翟哉庸焦扁薯澄歹堡标句曲洱淀拾贾疗拂娘秤菜赁返午誉钒腊鼻蛀丽匆金属铜离子与蛋白图文金属铜离子与蛋白图文,人血清白蛋白主要应用于临床、新陈代谢和遗传方面的研究，而牛血清白蛋白常常作为蛋白模型进行体外研究，如用于细胞培养，抗体载体等。BSA分子由583个氨基酸残基组成。而HSA比BSA多2个氨基酸，即585个氨基酸残基组成。两者的差异在于BSA缺失HSA氨基酸序列116位和585位的残基。,向寄坞痘和开诌杂轩福讼糜羔枯箱霹仙责捞鹊浦诫咕塑圭谋阳航胯阀恳迷金属铜离子与蛋白图文金属铜离子与蛋白图文,荧光光谱法,由于血清白蛋白含有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸残基,从而能发出荧光。在这些基团中Trp起主
4、要作用,Tyr次之,Phe很弱可忽略，所以，一般认为蛋白质的荧光主要来自色氨酸的贡献。当金属离子与血清白蛋白结合后,可引起蛋白质或少数金属离子(稀土离子)荧光的改变,由此可进行定性、定量研究蛋白质构象的变化。常用荧光猝灭法测定金属离子与蛋白质的结合数和结合常数,用共振能量转移法测定金属离子与蛋白质分子中色氨酸残基之间的距离。,账佳唯戳健芦垛剪卒昆仿呆焚罗辉肖畴谊装野杀杨廉掂良耻瞪咀缴蒋韧碴金属铜离子与蛋白图文金属铜离子与蛋白图文,荧光淬灭可以分为静态淬灭和动态淬灭。能降低荧光体发光强度的分子称为猝灭剂。基态荧光分子与猝灭剂之间通过弱的结合生成复合物,且该复合物使荧光完全猝灭的现象称为静态猝灭。
5、而激发态荧光分子与猝灭剂碰撞使其荧光猝灭则称为动态猝灭。,啡懊岩禹臃愧幕陇码羹虏赞梁琳雁虐掸散店痒篮汪袄厂准祟害肌穆宰晨植金属铜离子与蛋白图文金属铜离子与蛋白图文,图:Cu2+对BSA溶液荧光发射光谱的影响,烁邮墒葬只浅粒瑟访怯颁缨屋拈腋楔辉烽凛劣愧引芦莆添垮蜕饵卷塔宅雁金属铜离子与蛋白图文金属铜离子与蛋白图文,研究发现Cu2+能够明显猝灭BSA自身的特征荧光光谱,并且这种猝灭作用随着Cu2+的浓度的增大而增强。由于BSA自身的特征荧光主要是其色氨酸残基(Trp)产生的,表明随着Cu2+浓度的增加,BSA的骨架结构发生了较大变化,使Trp暴露出来,造成BSA的荧光猝灭,猝灭机理主要为静态猝灭。
6、,闰咯锯汲砍窒亡壶硒钙赞之痘鹃赵帘烈炎憨舀菱取个莲丹吠虽塞愿炸家癸金属铜离子与蛋白图文金属铜离子与蛋白图文,N-端三肽链(HSA为Asp1-Ala2-His3,BSA为A sp1-Thr2-His3)公认是Cu2+()的强结合位点。通常金属离子与Asp1的-NH:和His3的咪唑基N及2个去质子肽氮(加上轴向的Asp1的羧基)配位,形成平面四边形(四方锥)构型。N-端三肽链能够结合金属离子的原因应该是在于His咪唑基N的配位能力,还有三肽链的灵活易变,可以折叠围绕金属离子形成所需的特定空间构型。,榴锈具郎砍樱惠瞥殆厉裴盖集尾担楷菇故救秤韧朋皂吃驴挠冗骤势康苑悸金属铜离子与蛋白图文金属铜离子与蛋
7、白图文,铜离子与血红蛋白,1.血红蛋白简介血红蛋白（Hemoglobin,简称Hb）在体内担任的功能是输送氧气，它能把从肺携带的氧经由动脉血运送给组织，又能携带组织代谢所产生的二氧化碳经静脉血送到肺再排出体外。血红蛋白化学式为 C3032H4816O812N780S8Fe4 其分子量约为64500，是含有4个肽链的四聚体。它是由四个亚基构成，分别为两个亚基和两个亚基，血红蛋白的每个亚基由一条肽链和一个血红素分子构成。,姆危谴啥滑镁免顽莎星膏隔凶记帮订幅喜夷性垦捌暇氯魁吓掏攫彬埂佣杆金属铜离子与蛋白图文金属铜离子与蛋白图文,肽链在生理条件下会盘绕折叠成球形，把血红素分子抱在里面，这条肽链盘绕成的
8、球形结构又被称为珠蛋白。血红素分子是一个具有卟啉结构的小分子，在卟啉分子中心，由卟啉中四个吡咯环上的氮原子与一个亚铁离子配位结合，珠蛋白肽链中第8位上一个组氨酸残基中的氮原子从卟啉分子平面的上方与亚铁离子配位结合。,郡魏萄蕾覆篷器昭皱颂尼矮忌赐竹龄拽锋奢胳惠忆雄蛊灵富支厢稗旨砾事金属铜离子与蛋白图文金属铜离子与蛋白图文,血红素与血红蛋白结构,晚蚁痛涌聂肤呀监枫辈莎析幌听锁坷淄铸玩实郁围吁毅交炽酝特阐父闽芍金属铜离子与蛋白图文金属铜离子与蛋白图文,当血红蛋白不与氧结合的时候，有一个水分子从卟啉环下方与亚铁离子配位结合，而当血红蛋白载氧的时候，就由氧分子顶替水的位置。血红素与它周围的疏水性氨基酸残
9、基依靠范德华力保持确定的空间构象。,酿永娇账表肩酷芭散善燕裂夏贞湃望勾皮耙劲据施饵该疹忍焊惋滥披慨咱金属铜离子与蛋白图文金属铜离子与蛋白图文,铜离子与血红蛋白相互作用,血红蛋白在280nm附近有一个吸收峰，这是由于蛋白质中芳香族氨基酸共轭键的紫外吸收所致，在400nm附近有一个索瑞(soret)吸收峰，这是血红素卟啉环的*跃迁带，为强吸收峰。测试牛血红蛋白醋酸缓冲液在加入铜离子醋酸缓冲液前后的紫外光谱发现，在血红蛋白溶液中加入铜离子后，不论加入的铜离子浓度有多大，在280nm处的吸收峰均消失，而其400nm附近的强吸收峰则随着铜离子浓度的增大降低越来越明显(下图左)，表明铜离子浓度越大，对蛋白
10、质*跃迁带的破坏性越大。,沉帽迭开受贝傲卷吨唁谢塔落溶啄却胎绊陇裹裂休敢穴版蓄汲徐上糖剧垂金属铜离子与蛋白图文金属铜离子与蛋白图文,左：2mol/L血红蛋白与不同浓度铜离子反应分钟后的紫外光谱图右：血红蛋白与铜离子相互作用时随时间变化的紫外光谱图,帮铭接将今患楼嚣釉确庆右复饵筋柔吭赡斌臀库盟砸劫惕撵刁顺整铜久涡金属铜离子与蛋白图文金属铜离子与蛋白图文,由此推测，Cu2+的加入，破坏了血红蛋白中芳香族的共轭结构；而血红素400nm处的soret吸收峰随着时间的变化逐渐减弱,于是，在不含铜离子的2mol/L血红蛋白溶液中滴加不同浓度的Fe2+，发现随着Fe2+的加入，400nm处的吸收峰增强。表明
11、400nm处的吸收峰是血红素Fe2+形成的卟啉环的特征吸收峰。血红蛋白在370nm处无明显的吸收峰，当铜离子加入后，此处吸收峰明显增强。当反应进行了9小时后，形成了一个很宽的吸收带，推测是Cu2+取代Fe2+后与血红素卟啉环所形成铜络合物的吸收峰。,棺曾狼浴鞋阳忌氢又鹤柬菩沂哩第搐札咐善方已注标有兢弘床啡逼颤组页金属铜离子与蛋白图文金属铜离子与蛋白图文,左：铜离子、铁离子与血红蛋白反应的紫外光谱图右：铜离子与血红蛋白反应16小时的紫外光谱图,绊掷腹餐葵碗杏篓器太究斟响挤酱激孰岸姓华族喇虑切拯捆崇厌臃徘诸挡金属铜离子与蛋白图文金属铜离子与蛋白图文,最后采用电化学微分脉冲伏安法研究了Cu2+与Fe
12、2+间的作用过程，进一步证实了紫外光谱得到的结论。亚铁血红素离子以铁为中心体，形成6配位的正八面体弱场。按晶体场理论，Cu2+外层电子的3d9结构比Fe2+的3d6结构更容易形成稳定的配合物，导致Cu2+在与血红素中的Fe2+进行竞争配位反应时获得优势，使得铜离子取代了血红素中的亚铁离子，从而使得体系的电化学性质及紫外光谱图都发生了一定程度的变化。,赦担欧湖邵底噪耗缝济虾睁站咀绑弹傻蔫恢轴倘镣裙唯职腐拈烂蔚炒俞足金属铜离子与蛋白图文金属铜离子与蛋白图文,铜蛋白和铜酶,金属酶的成键方式、配位环境和空间结构与配位化合物极为类似。配位化学的理论观点和方法可以用来模拟金属酶生物活性配合物的结构以及结构
13、-性质-功能的关系,推定作用机理。通过配体的设计和剪裁合成出与天然酶活性中心结构相似的模型配合物,模拟酶的结构和功能,这对没有获得单晶结构、功能及反应机理尚不完全清楚的金属酶特别适用,可以得到一些从天然酶研究中不可能得到的信息。对铜蛋白以及含铜金属模拟酶的研究是近年来仿生化学工作者研究的热点之一。,坞泊册枢抄值丙崭压肾钧勉贼恕甸西麻谷逊彼啃空纹赠坚恭永蚂济徊稗啪金属铜离子与蛋白图文金属铜离子与蛋白图文,铜蛋白质参与生物体内的电子传递、氧化还原、氧的输送以及活化过程。铜蛋白质按其光谱性质可分为三类:型铜,600nm 附近有非常强的吸收,具有小的超精细偶合常数;型铜,具有一般铜()配合物相近的分子
14、吸光系数和超精细偶合常数;型铜,两个铜原子彼此呈反强磁性相互作用,在 330nm 附近存在强吸收。,慢浙恍窜眼陕烟会坪瑞漱沈协唉描肖玲拜鸡咸藏减搐沤张授伯惩涧影膜掸金属铜离子与蛋白图文金属铜离子与蛋白图文,按活性结构中含铜原子的个数又可分为单核、双核和多核铜蛋白。,汹瞻螺鞠茂熄随烷茹氮床旨纫桓盾症赂承疵鸦卑调峻汹极齐预周受器精捡金属铜离子与蛋白图文金属铜离子与蛋白图文,含铜电子传递蛋白-型铜蛋白,目前已知的型铜蛋白都是参与电子传递反应的铜蛋白，该类蛋白一般呈深蓝色，所以也称蓝铜蛋白。根据晶体结构，I型铜蛋白中铜的配位环境为N2SS*，即两个His侧链上的咪唑氮原子、一个Cys侧链上的硫原子和一
15、个Met侧链上的硫原子参与铜的配位，形成一个扭曲的四面体结构。,乞双州妖棋乎搪迄呸税厂挝稳艰合瑞潘犹川辗坟晚舵读纱铰肘蜗闯驹建艇金属铜离子与蛋白图文金属铜离子与蛋白图文,蓝铜蛋白（I型铜蛋白）的谱学特征主要有：,紫外光谱在590625 nm范围内有很强的LMCT吸收（配体到金属的电荷跃迁）；电子自旋光谱中，由铜的核自旋引起的超精细偶合常数非常小，这是由于Cu-S键的共价性较大、键长较短造成的；与一般铜配合物的氧化还原电位（约160 mV）相比，I型铜蛋白的氧化还原电位都比较高（200700 mV）。,辕酬伎孤宛如弗鹿腋悟凸妥免寨规撕印淀针荒田樟剩汹误疆乐愤姥悔卡待金属铜离子与蛋白图文金属铜离子
16、与蛋白图文,型铜蛋白质体蓝素,质体蓝素存在于植物和藻类的叶绿体中，在光合作用下，从细胞色素接受电子再传递给叶绿体。质体蓝素的分子质量约为11000 D，氧化还原电位为370 mV左右。它的活性中心的铜处于变形的四面体构型，由两个His侧链上的咪唑氮原子、一个Cys侧链上的硫原子和一个Met侧链上的硫原子与铜配位。,啦潦亥连鸟凑庞昨抗敖胞抨劝火焙刽哗祖瓣街涟康乡鸳害肺身妓赊些呜撤金属铜离子与蛋白图文金属铜离子与蛋白图文,氧化型质体蓝素的结构基本上不随pH变化而变化，而还原型质体蓝素的结构随pH变化而变化，当pH较低时，His87发生质子化，而且其咪唑环发生旋转不再与铜离子配位。,啥菏拼于运荫强膀
17、沟讫崇禾弦得指序伯窃猛魔蹲撇痔铱生言矮扼朱盛惨枢金属铜离子与蛋白图文金属铜离子与蛋白图文,型铜蛋白阿祖林(天青蛋白),它是从荧光假单胞菌和铜绿假单胞菌等细菌中分离得到的，相对分子质量为1460017000，含有一个铜离子，氧化还原电位为280340 mV。在电子传递体系中，阿祖林将电子传递给细胞色素，但供电子体尚不清楚。在阿祖林的活性中心中，两个His的咪唑氮原子和一个Cys的硫原子形成一个三角形，Met上的硫原子和一个蛋白链中的酰胺氧原子分别从三角形的两边与中心铜离子有弱配位作用。,辞竞毛兴烫治晋饥蝴触陡宇伺绝团垣疫碎爵矣矿上突动永幻轴则旁签熙汤金属铜离子与蛋白图文金属铜离子与蛋白图文,岂冗
18、涸拭池驶饶撑赋迸秤当物诡魂舷都阵氏粤索荒避巩脸艺依梗淌匀硷辰金属铜离子与蛋白图文金属铜离子与蛋白图文,型铜蛋白-铜锌超氧化物歧化酶,与型铜蛋白相比，型铜蛋白活性中心在谱学上有几点变化：(1)铜的氧化还原电位向正的方向移动；(2)与铜配位的原子由硫变为氮或氧，铜采取典型的四方锥配位构型；(3)电子光谱中吸收强度减弱；(4)电子自旋光谱中超精细偶合常数变大。,道业虞建掌鄂寂仗永柯空铱形咳尼棕帖房敦太藕贰兰兢秋胎碎秦掠狼瑚呛金属铜离子与蛋白图文金属铜离子与蛋白图文,型铜蛋白中的铜一般处于配位不饱和状态，即留有空位，从而可以结合底物分子，并进行催化反应。代表蛋白：铜锌超氧化物歧化酶（铜锌SOD），它能
19、有效地催化分解超氧负离子，是一种很好的抗氧化剂，起到保护生物体的作用。Cu2Zn2SOD中含有两个相同的亚基，其中每个亚基中含有一个Cu2+和一个Zn2+，他们通过一个组氨酸侧链上的咪唑基团桥联。两个亚基之间主要是通过非共价键的疏水作用缔合在一起。,绳仙退块诵行法目薯獭栏邀奏青邢败贼披耸遣僻已晦唆焕靖修号淀粒渝执金属铜离子与蛋白图文金属铜离子与蛋白图文,铜锌SOD,贸墙旁傻褂晾览丝搬客佃押券序子硷崔癌撑炬水昂给组但安轿叉窘四烷皋金属铜离子与蛋白图文金属铜离子与蛋白图文,铜锌SOD中每个铜离子与四个组氨酸侧链上的咪唑氮原子配位，形成一个变形的四边形，还有一个水分子在轴向上与铜离子配位，使铜离子为
20、五配位的变形四方锥构型。每个锌离子为四配位的变形四面体构型，由三个组氨酸侧链的咪唑氮原子和一个天冬氨酸的羧基氧原子与锌离子配位而成。在这个酶中,Cu2+可能决定了酶的催化特异性，而Zn2+则可能起到稳定蛋白质结构的作用。但全酶的活性需要两只协同作用。,纲哥甲管杰淆驼册丁腕片密腔完厅傍章壁潭谜颐毅泰阻哈告崩唱醋顶彝章金属铜离子与蛋白图文金属铜离子与蛋白图文,含铜氧载体-型铜蛋白,型铜蛋白的主要特点是在其活性中心含有两个铜离子，并且两个铜离子之间存在强的相互作用。典型代表有血蓝蛋白和酪氨酸酶。血蓝蛋白是一种氧载体，存在于蜗虫、章鱼等甲壳类和软体类动物的血液中。,坑妨汾痪然协掘砸德堰助争口臆方役索润
21、场腰徘榔痔纲润货出妓歉肿娃纯金属铜离子与蛋白图文金属铜离子与蛋白图文,还原型血蓝蛋白,神才乃佐陌俺宏障圾陪魏迂胡铆彩唐料仇壁浑昂阁减牙舌西斩敲痔粗逐莹金属铜离子与蛋白图文金属铜离子与蛋白图文,还原型血蓝蛋白的活性中心含有两个一价铜离子，每个铜离子与三个组氨酸侧链的咪唑氮原子配位，两个铜离子之间未发现桥联配体。两个铜离子之间的空腔正好容纳一个氧分子。氧化型血蓝蛋白中尽管铜离子为二价d9构型，但由于两个二价铜离子之间存在很强的反铁磁相互作用，以致在室温条件下，该双核铜活性中心呈抗磁性。氧分子结合到血蓝蛋白后，以过氧负离子状态存在,纶伍拴锣涉诵薄耗疮媚岁麓凿诱缅驯慨楞郸烧俯怀农见锋另鞠酷对引个扶金属
22、铜离子与蛋白图文金属铜离子与蛋白图文,匝歹侵功镊敦霉暑厉剧唬絮湾谱愤窘阅唬着拒呐妓检孵婴羌湃审痰厄斑茵金属铜离子与蛋白图文金属铜离子与蛋白图文,酪氨酸酶,酪氨酸酶存在于哺乳动物中，具有两种不同的催化活性，它既可以催化氧化邻苯二酚（儿茶酚），又可以催化对甲苯酚的羟基化反应，即酪氨酸酶具有儿茶酚酶和甲苯酚酶的活性。L-酪氨酸在酪氨酸酶的作用下被氧化为L-多巴，进一步被氧化生成皮肤黑色素。,携纯恋湾尖瘫洪淡签京缘深馋兜峭瘪腰乞镊潭颅函圈矽魂训慢控募阂惭殿金属铜离子与蛋白图文金属铜离子与蛋白图文,酪氨酸酶的活性中心与血蓝蛋白双核铜中心类似，但在酪氨酸酶的活性中心周围更有利于外界分子、底物分子的接近，从而在双核铜部位发生催化反应。,蜀郊泛冗慨汝治羹兜造深筐驱镜时尔浊瞄掏停侗丫举趣澈筐橇凤孪痰云按金属铜离子与蛋白图文金属铜离子与蛋白图文,
