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1、第2章均相酶反应动力学,均相酶反应指酶与反应物系处于同一相液相的酶催化反应。动力学指反应速率与其影响因素的关系。动力学方程反应速率与其影响因素间关系的式子。因为反应物系均处在同一相中，所以不存在相间的物质传递不考虑传递影响的动力学本征动力学。而非均相，考虑传递影响的动力学宏观动力学。,目录,2.3 反应条件对酶反应速率的影响,2.2 有抑制酶催化反应动力学,2.1 单底物酶催化反应动力学,2.1单底物酶反应动力学,单底物酶催化反应动力学是指由一种反应物（底物）参与的不可逆反应属于此类反应的有酶催化的水解反应和异构化反应这种简单的单底物酶催化反应动力学，是酶反应动力学的基础。,式中:rs底物S的
2、消耗速率，mol/(L*s)；rP产物P的生成速率，mol/(L*s)；反应体系的体积，；（也叫反应体积=反应器有效 体积=反应混合物体积)，此体积区别于反应器体积；ns底物S的摩尔数，mol；np-产物P的摩尔数，mol；t反应时间，s。,反应速率表示：,讲二个概念：,反应速率：单位反应时间，单位反应体系中某一组分的变化量。,反应动力学：研究反应速率与其影响因素的关系。,对均相酶催化反应，单位反应体系常用单位反应体积表示。,对于底物S，dnS/dt0，因此用S来计算反应速率时，常加一负号，以使反应速率恒为正值。而P为产物，dnP/dt0，故用P来计算反应速率时，则不需要加负号。,对液相反应可
3、视为恒容过程,则:,中间复合物学说：,反应机理为：,式中ES为酶底物复合物；k+1,k+2,k-1为相应各步的反应速率常数。,根据质量作用定律，P的生成速率可表示为：rP=rS=k+2CESCES中间复合物ES浓度，为难测定的未知量，因而不能用它来表示最终速率方程要用易测定的量表示。下面的任务就是求CES。,第一次结束8月28日,有MichaelisMenten(米彻利斯和曼吞)快速平衡法和BriggsHaldane（布里格斯一霍尔丹）拟稳态法两种方法推导动力学方程。,在求CES时，对中间产物学说所提出的反应机理做如下假设：在反应过程中，酶的浓度保持恒定，CE0=CE+CES。与CS相比，CE
4、很小，所以可忽略由于生成ES而消耗的S。产物浓度很低，可忽略P抑制作用，也无须考虑P+EEP这个逆反应。初始状态时.,根据上述假设，有MichaelisMenten和BriggsHaldane两种方法推出各自的速率方程。,2.2.1 Michaelis-Menten方程 2.2.2 Briggs-Haldane方程 2.2.3 动力学特征与参数求取,目录,2.Michaelis-Menten方程平衡态法,假设：,k+1CSCE=k-1CES(2-3),令KS=k-1/k+1(解离常数，也叫平衡常数或饱和常数，mol/L）,CE0=CE+CES(2-4),由（2-3）（2-4）得 CES=,(2
5、-5),推导动力学：rS=k+2CES(2-2),代入（2-2）得：,rS，maxS的最大消耗速率，mol/(Ls);CE0酶的总浓度，亦为酶的初始浓度，mol/L.,两个重要的动力学参数，即KS和rS，max。,，KS单位与CS单位同。KS物理意义：当 时，KS=CS，KS表示酶与底物相互作用的特性。,rS，max=k+2CE0，表示当全部酶都呈复合物状态时的反应速率。,(2-6)M-M方程（米氏方程）,rS=k+2CES,第1次结束09.3.10,.Briggs-Haldane方程拟稳态法,假设：dCES/dt=0,且 dCES/dt=k+1CECS-k-1CES-k+2CES=0(2-8
6、)则k+1CECS=(k-1+k+2)CES 又 CE0=CES+CE(2-9),则,(2-10),则,推导动力学方程：rS=-=k+2CES(2-7),B-H方程,Km与Ks关系是：Km=（k-1+k+2）/k+1 Ks=k-1/k+1 k+2 k-1，Km=Ks。,因为生成的ES结合力很弱，所以解离速率很快；而复合物生成产物则包括化学键的生成和断开，其速率当然要慢的多。这对许多酶反应是正确的。,比较上述两方程:,M-M方程,米氏方程即为:,引出两个参数：rS,max和Km。,-表示rS与CS的关系。,Km表示与亲和力的大小Km大，表示亲和力弱，易解离，Km小，亲和力强，不易解离，对某一特定
7、的酶，在一定条件下，进行酶催化反应，Km为特征常数。,rS,max可表示为：rmax，M-M方程通常表示为：,.动力学特征与参数求取,1.动力学特征：M-M方程表示反应速率与底物浓度关系，即rs-Cs关系,此关系作图。得曲线表示三个不同动力学特征区域。,当csKm,曲线近似为一直线，近似看成一级反应。,式中CS0底物初始浓度，mol/L。,则,当CSKm时，近似为一水平线，零级反应。,当Cs与Km相当符合M-M方程表示形式,用转化率表示：,则,而转化率（底物）：,第2次结束9月25日,2.参数求取：rmax,Km,通过实验可得数据：t-CS。,将M-M方程线性化，如将实验数据代入得到直线，则证
8、明M-M方程成立，并进而求取rmax,Km。关键是线性化，下面介绍线性化方法。,1.微分法（）Lineweaver-Burk法(莱因韦费-伯克)（简称L-B法）,将M-M方程取其倒数得：,以1/rs对1/Cs做图，得一直线，该直线斜率Km/rmax,纵坐标截距：1/rmax,横坐标截距为：-1/Km,此法又称双倒数图解法采用较多,（）Hanes-Woolf法(恒适-伍尔夫)（简称H-W法）,将,两边均乘以Cs,得到：,以Cs/rs对Cs作图，得一直线，斜率：rmax,纵轴截距为Km/rmax,横轴截距为-Km。又称Langmuir作图法。,Eadie-Hofatee法（伊蒂霍夫斯第）（简称E-
9、H法）,将M-M方程重排为：,以rs对rs/Cs做图，得一直线，斜率为-Km，纵轴截距rmax,横轴截距rmax/Km。,M-M方程积分得：rmaxt=(CS0-CS)+KmCS0/CS KmCS0/CS=rmaxt-(CS0-CS)除以Km（CS0-CS）：(CS0/CS)/(CS0-CS)=（rmax/Km）t/(CS0-CS)-1/Km.实验已测得t-CS，则做(CS0/CS)/(CS0-CS)与t/(CS0-CS)图得一条直线，证明M-M方程成立，直线斜率为rmax/Km，纵截距=-1/Km，横截距=1/rmax。,积分法,例2-1 有一均相酶反应，Km值为210-3mol/L。当底物
10、的初始浓度CS0为110-5mol/L，若反应进行1min，则有2%的底物转化为产物。试求出：（1）当反应进行3min，底物转化为产物百分数是多少？(k1=0.02min-1，XS=6%)此时底物和产物的浓度分别是多少？(CS=0.9410-5mol/L，CP=610-7mol/L)（2）当CS0为110-6mol/L，也反应了3min，底物和产物的浓度分别是多少？(CS=0.9410-6mol/L，CP=610-8mol/L)（3）最大反应速率rmax值为多少？（k1=rmax/Km=0.02min-1，rmax=4.0410-5mol/（Lmin）,Km CS0,例2-2 室温下蔗糖在蔗糖
11、酶的催化作用下水解得到产物。蔗糖的初始浓度CS0=1.0mmol/L，酶的初始浓度CE0=0.01mmol/L。现在一间歇式操作的实验反应器测得了不同时间下蔗糖的浓度(见表)，根据实验提供的数据确定:（1）该反应速率能否用M-M方程描述？（2）若可以，试求动力学参数Km和k+2的值。,第二次结束8月30日,2.2有抑制酶反应动力学,抑制剂：凡使酶的必须基团化学性质改变而降低酶活力甚至使酶活力完全丧失的物质称抑制剂，其作用称为抑制作用。,根据抑制剂的不同可分为：底物抑制，产物抑制，外源化合物做抑制剂的抑制剂抑制。,抑制剂的抑制作用分为不可逆抑制，可逆抑制。,不可逆抑制作用：抑制剂与酶结合是不可逆
12、反应，不能用透析等物理方法除去抑制剂而恢复酶活性抑制剂与酶共价结合,可逆抑制作用：抑制剂与酶结合是可逆反应，可以用透析等物理方法除去抑制剂而恢复酶活性抑制剂与酶非共价结合。,可逆抑制根据抑制机理不同，又分为竞争性抑制，非竞争性抑制，反竞争性抑制和混合型抑制。,抑制作用,可逆抑制,不可逆抑制永久失活,抑制剂抑制作用,竞争性（抑制动力学）,非竞争性（抑制动力学）,反竞争性（抑制动力学）,底物抑制作用（动力学）,产物抑制作用（动力学）,2.2.1 竞争性抑制动力学,2.2.2 非竞争性抑制动力学,2.2.3 反竞争性抑制动力学,2.2.4 各种抑制的比较,目录,1.定义：抑制剂与底物竞争与酶的活性部
13、位结合，当抑制剂与酶的活性部位结合之后，底物就不能再与酶结合，从而降低了酶与底物结合的机会，使酶催化底物的反应速率下降，称竞争性抑制作用，该物质称竞争性抑制剂。,.2.竞争性抑制动力学,3.推导动力学：rSI=k+2CES,根据拟稳态假设，得：dCES/dt=k+1CECS-(k-1+k+2)CES=0 dCEI/dt=k+3CECI-k-3CEI=0 kI=k-3/k+3又CE0=CE+CES+CEI 式中CI抑制剂浓度，CEI非活性复合物浓度,经整理得：,式中 rSI有抑制时的反应速率，mol/(L*s)；KmI有竞争性抑制时的米氏常数，mol/L；KI抑制剂解离常数，mol/L.,将（1
14、-2）式代入（1-1）式得：,（1-1）,（1-2）,4.动力学特点：,有竞争性抑制剂存在时，Km值增大(1+CI/KI)倍，且Km值随CI的增高而增大；最大反应速度不变。,竞争性抑制作用的LineweaverBurk图,1.定义：I不与S竞争与E结合，I与E结合后，S也可与E结合，只是生成的ESI三元复合物不反应，而使rSI，为非竞争性抑制。,2.2.2 非竞争性抑制动力学,2.机理：,3.推导动力学,令：Km=k-1/k+1=CECS/CES,k+5CEICS=k-5CSEI,k+1CECS=k-1CES,令：KI=k-3/k+3=CECI/CEI=CESCI/CSEI=k-4/k+4,令
15、：Km=CEICS/CSEI=k-5/k+5,CE0=CE+CES+CEI+CSEI,k+3CECI=k-3CEI k+4CESCI=k-4CSEI,整理得：,而,利用平衡态假设,式中rI,max存在非竞争性抑制时最大反应速率。,4.动力学特点：,有非竞争性抑制剂存在时，rmax值减小（1+CI/KI)倍，且rmax值随CI的增高而降低；Km值不变。,非竞争性抑制作用的LineweaverBurk图,1.定义：抑制剂不能直接与游离酶相结合，而只能与复合物ES相结合生成SEI复合物。生成的ESI三元复合物不反应，而使rSI，为反竞争性抑制。,2.2.3 反竞争性抑制动力学,3.动力学推导：rSI
16、=k+2CES,平衡态假设Km=k-1/k+1=CECS/CES,得：,且KI=k-3/k+3=CESCI/CESI另：CE0=CE+CES+CESI,or,有反竞争性抑制剂存在时，Km和rmax值均减小（1+CI/KI）倍，且都随CI的增高而降低。,km,kmI,4.动力学特点：,反竞争性抑制作用的LineweaverBurk图,对竞争性抑制，非竞争性抑制和反竞争性抑制的抑制动力学特点进行比较,表 有抑制时酶催化反应动力学参数,2.2.4 各种抑制的比较,为了表示抑制剂对酶催化反应的抑制程度，引出抑制百分数（i）其定义式为：,式中：rS无抑制时酶催化反应速率，mol/(L*s)rSI有抑制时
17、酶反应速率，mol/(L*s)i抑制百分数,i值愈大，表示抑制程度愈大，i值愈小表示抑制程度愈小0i1。,对竞争性抑制：i=1-rSI/rS=1-rmaxCS/Km(1+CI/KI)+CS/rmaxCS/（Km+CS）=CI/KI(1+CS/Km)+CI 可见，CS,i.抑制程度,对非竞争性抑制:i=CI/（KI+CI）。可见，抑制程度与CS 无关,对反竞争性抑制:可以求出：i=CI/KI(1+Km/CS)+CI 可见，CS,i。,可通过上述方法来判断抑制的类型。,例2-3 在含有相同酶浓度的五个反应物系中，分别加入不同浓度的底物，并测定其初始速率，然后再在同样五个反应物系中分别加入浓度为2.
18、210-1mmol/L的抑制剂,并测定其初始的反应速率,其数据见下表。试根据上述数据决定其抑制类型及动力学参数值。,102,102,1/rmax=0.01rmax=100mmol/（Lmin）,抑制类型是竞争性抑制。,1/Km=4.21/KmI=2.2,Km=0.24mmol/LKmI=Km（1+CI/KI)=0.44,KI=0.27mmol/L,例2-4 某酶的Km值为4.7105mol/L，如果rmax值为2.2 105mol/(Lmin)，在底物浓度为2104mol/L和在(1)竞争性抑制剂与(2)非竞争性抑制剂的浓度均为5 10-4mol/L情况下，其反应速率分别为多大？rSI竟=1.
19、35105mol/（Lmin），rSI非=6.68106mol/（Lmin）(3)假定在上述情况下KI值均为3104mol/L，则在上述两种抑制情况下的抑制程度各有多大？rS=1.78105mol/（Lmin），i竟=0.24，i非=0.625,第三次结束9月4日,影响酶催化反应速率的因素是很多的，通常分为,内部因素：包括酶的结构特性和底物的结构特性由反应体系所决定（不为此门课所讨论）。,外部因素：包括各种物质的浓度（酶浓度、底物和产物浓度，抑制剂浓度）和操作条件（如温度、压力、离子强度、pH值）。,本节讨论对酶催化反应速率影响最明显的两个因素，即pH和温度,2.3 反应条件对酶反应速率的影响
20、,2.3.1 pH值的影响,2.3.2 温度的影响,2.3.1 pH值的影响,（1）引言：酶是蛋白质，蛋白质是由氨基酸组成，酶分子上有许多酸性和碱性的Aa侧链基团，如果酶要表现其活性，则这些基团必有一定的解离形式。pH值改变氨基酸解离状态改变酶催化能力改变酶催化反应速率改变，所以pH影响到酶催化反应速率，下面讨论pH与rS的关系。,（2）三状态模型,假定酶分子有两个可解离基团，随着pH值变化，分别呈EH2,EH-及E2-三种状态，即：,基本要点如下：,三种解离状态中，只有EH-型具有催化活性。,酸性条件下，酶呈EH2状态；pH，酶以EH-状态存在。pH继续，酶又以E2-状态存在。,底物S的解离
21、状态不变。,速率控制步骤为EHS-生成产物P。,（3）反应机理式：,（4）推导动力学方程：,CE0=CEH2+CEH-+CE2-+CEHS-+CEH2S+CES2-,定义：Ka=CEH-CH+/CEH2,Kb=CE2-CH+/CEH-Ka=CEHS-CH+/CEH2S,Kb=CES2-CH+/CEHS-,rS=rP=k+2CEHS-,Km=CEH-CS/CEHS-,经整理可得到下式：,则：,式中Ka,Ka,Kb,Kb所定义的各解离常数,CH+氢离子浓度pH=-lg CH+,由上可见，f1，f2均与pH有关，进而rS也就与pH有关,2.3.2 温度的影响,对酶催化反应，只有在较低的温度范围内，T
22、，rS，超过某一温度（生理允许温度），T，rS。原因：T，虽可加速酶的催化反应速率，同时也加快了酶的热失活速率,k+2，Km受温度影响。,在适宜的温度时，k+2与T关系符合Arrhenius方程，即：k+2=Aexp(-Ea/RT),lnk+2=-Ea/RT+lnA,k+2与温度关系,式中：A指前因子Ea反应活化能 R气体常数，T绝对温度,根据Eryring（埃林）的过渡状态理论，描述k+2与T的关系式可表示为：k+2=ATexp(-H*/RT),以lnk+2对1/T作图，得一直线，斜率为-Ea/R，可求Ea。,式中：H*反应的标准活化焓变；A修正的指前因子,当酶催化反应服从M-M快速平衡机理
23、时，Ks（=Km）与T关系可认为服从Vant-Hoff方程（范特荷甫方程）,Km与温度关系,Ks=Km=Aexp（-H/RT）,式中：H反应热，A修正指前因子。,如果在M-M方程中表示温度的影响，则有：,习题,2-1 一分批进行的均相酶反应，底物的初始浓度为310-5mol/L，Km=110-3mol/L，经过2min后，底物转化了5%。假定该反应符合M-M方程,试问当该反应经过10min、30min和60min时,该底物转化了多少？,2-2 某酶反应,其Km=0.01mol/L。为了求其最大反应速率rmax值，现通过实验测得该反应进行5min时，底物已转化了10%，,已知CS0=3.410-
24、4mol/L，并假定该反应可用M-M方程表示。试求：（1）最大反应速率rmax为多少？（2）反应15min后，底物浓度为多少？,2-3试根据下列实验数据确定rmax、Km和KI值，并说明该酶反应是属于竞争性抑制还是属于非竞争性抑制。,2-4 某一酶反应Km值为4.710-5mol/L，rmax=22mol/(L min)，CS=2 10-4mol/L，CI=510-4mol/L，KI=5 10-4mol/L。试分析计算在竞争性抑制、非竞争性抑制、反竞争性抑制三种情况下的反应速率和抑制程度。,2-5 在某种水解酶的作用下葡萄糖-6-硫酸可以分解为葡萄糖和硫酸。在一定的酶浓度下，测得M-M方程中的参数Km=6.7 10-4mol/L，rmax=3 10-7mol/(Lmin)。对该反应，半乳糖-6-硫酸是一竞争性抑制剂。当CS0=2 10-5mol/L，CI0=110-5mol/L时，测得反应速率rSI=1.5 10-9mol/(Lmin)。试求KmI和KI值。,
