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1、第一章 蛋白质工程绪论,一、pro工程的概念二、pro工程的程序 三、pro工程研究内容四、pro工程的产生与发展,一、pro工程的概念,1、pro工程的诞生,1983年，美国生物学家Ulmer博士在Science上发表了以“Protein Engineering”为题的专论，首次明确提出pro工程的概念，标志着pro工程的诞生。,2、pro工程的概念,蛋白质工程是以蛋白质的结构与功能为基础，利用基因工程的手段，按照人类自身的需要，定向地改造天然的蛋白质，甚至创造新的、自然界本不存在的、具有优良特性的蛋白质分子。,蛋白质工程是指通过生物技术手段对蛋白质的分子结构或者对编码蛋白质的基因进行改造，
2、以便获的更适合人类需要的蛋白质产品的技术。,蛋白质工程是指通过蛋白质化学、蛋白质晶体学和动力学的研究，获取有关蛋白质物理和化学等各方面的信息，在此基础上利用生物技术手段对蛋白质的DNA编码序列进行有目的的改造并分离、纯化蛋白质，从而获取自然界没有的、具有优良性质或适用于工业生产条件的全新蛋白质的过程。,被称为“第二代基因工程”,Pro工程诞生的基础,1）新的克隆技术，特别是完整的cDNA克隆技术；2）快速测定DNA序列测定；3）从DNA序列推算pro顺序的较好的计算机程序；4）pro顺序数据库的建立，使一级结构相似的蛋白能被很快地鉴定出来，并由此研究其功能上的相似性；5）对原核生物和真核生物基
3、因表达调控的进一步深入了解；6）用基因体外诱变的化学、酶学和合成技术的进展；7）X光晶体学的进展，包括较好的长浸提策略，同步辐射的应用，电子区域检测器的出现，以及计算机辅助的数据分析；8）用计算机图像系统为工具直接观察晶体数据；9）核磁共振技术的改进，使溶液中原子分布能得到直接检测。,二、pro工程的程序,筛选纯化需要改造的目的蛋白，研究其特性常数等；,制备结晶，并通过aa测序、X射线晶体衍射分析、核磁共振分析等研究，获得pro结构与功能相关的数据；,结合生物信息学的方法对pro的改造进行分析,由aa序列及其化学结构预测pro的空间结构，确定pro结构与功能的关系，进而从中找出可以修饰的位点和
4、可能的途径；,根据aa序列设计核酸引物或探针，并从cDNA文库或基因文库中获取编码该蛋白的基因序列；,在基因改造方案设计的基础上，对编码蛋白的基因序列进行改造，并在不同的表达系统中表达；分离纯化表达产物，并对表达产物的结构和功能进行检测等。,三、pro工程的研究内容,1、pro的结构和功能,2、pro的结构、功能设计和预测,3、pro的结构修饰,1、pro的结构和功能,每一种pro有自己独特的aa顺序，pro功能部位的几个aa残基决定着pro的功能，这几个负责功能的aa残基必须处于一个及其精密的空间状态下才能发挥功能。这就是说，只要能维持pro结构域的必需aa及空间构象不变，其功能域的生物学活
5、性就会保持不变。所以只要改变构成遗传密码的一个或两个碱基就能通过改变aa达到改造pro的目的。,pro分子设计按照被改造部位的多寡分为三种类型：,2、pro的结构、功能设计和预测,“大改”，即在了解pro结构和功能的基础上，从pro一级结构出发，设计自然界不存在的全新pro。,“小改”：对已知结构的pro进行几个残基的替换来改善pro的结构和功能；,“中改”：对天然pro分子进行大规模地肽链或结构域替换以及对不同pro的结构域进行拼接组装；,通过物理、化学法修饰pro侧链基团、水解肽链等；生物化学法利用蛋白酶选择性分割pro，采用基因重组技术或人工合成DNA，改造蛋白，甚至合成新的pro。,3
6、、pro的结构修饰,四、pro工程的产生与发展,1、pro工程与其他技术相互渗透,（1）pro工程与发酵工程发酵工程可以利用基因技术和细胞杂交技术选育出一大批生长速度快、代谢能力强、易于大量表达外源产物的新菌种，可为pro工程提供优良稳定的工程菌株，并可为pro工程中前期材料的制备等奠定重要基础。,（2）pro工程与基因工程 pro工程是从DNA水平改变基因入手，通过体外重组技术改造pro或设计合成具有特定功能新pro的新兴研究领域，也就是说pro的改造通常需要经过周密的分子设计，进而依赖基因工程获得突变型pro。目前，基因工程已为实现pro工程提供了基因克隆、表达、突变及活性检测等关键技术。
7、,（3）pro工程与细胞工程 细胞工程是指以细胞为单位，在细胞和亚细胞水平上有目的地进行遗传操作，通过细胞融合、核移植等方法，培养出人们需要的新物种，克服了源远杂交的局限性。目前，细胞工程技术已为pro工程提供了改良性状的微生物细胞以及稳定的动植物细胞系，以便更好的生产pro；另外，细胞工程可通过细胞融合、转基因技术改变生物的遗传性状或实现新型生物的构建，进而为pro的生产提供更多良好的载体。,（4）pro工程与酶工程 由于大部分酶的化学本质是pro，因此酶工程与pro工程的发展密不可分。,（5）pro工程与生物信息技术 利用生物信息学可以进行pro结构的预测，其目的就是利用已知的一级序列来构
8、建pro的立体结构模型。,2、pro工程的发展简史,1926年，Sumner从刀豆中提纯了脲酶，首次证明酶的本质是pro。,1932年，英国化学家Krebs等提出合成尿素的鸟氨酸循环多酶反应途径。,1937年，Krebs公布了三羧酸循环的研究成果。,1940年，德国生化学家Embclen和Megerbof公布了糖酵解途径。随后，脂肪酸氧化和核苷酸代谢途径也相继被阐明。同时期，我国生物化学家吴宪等提出pro变性学说。,1953年，英国生物化学家桑格破译出由17种51个aa组成的牛胰岛素两条多肽链的全部结构。,1965年，我国首先在世界上成功人工合成了具有天然生物活力的pro结晶牛胰岛素。,197
9、5年，OFarrel建立了双向电泳（2-DE）技术，可以用于组织与细胞中大规模pro的分离。,20世纪80年代末期，Hillenkamp发展了激光解吸质谱，Fenn设计了电喷雾质谱，可以高效、精确地测量生物大分子的质量并测定部分序列，进而用于数据库的检测；Mann通过建立“肽指纹图谱与肽序列标签”等技术，实现了质谱准确、快速、自动化和大规模鉴定pro的飞跃。,1982年，Winter等首次报道通过基因定点诱变获得改性。,1983年，Ulmer在Science上发表了Protein Engineering的专论，标志着pro工程的正式诞生。,1982年1985年，Forsht等对酪氨酰tRNA合
10、成酶的分子进行了改造，根据X射线衍射实测该酶与底物结合部位的结构，通过定点突变技术改变与底物结合的aa残基，还用动力学方法测量所得变体酶的活性，深入探讨了酶与底物的作用机制，这就是最早的pro工程。,1984年，Perry通过将溶菌酶中Ile3改成Cys3，并进一步氧化成Cys3-Cys97二硫键，提高了酶的热稳定性，显著改进了溶菌酶在食品工业的应用价值。,1987年，Forsht将枯草杆菌蛋白酶分子表面的Asp99和Glu156改成Lys，而导致活性中心His64质子pKa从7降到6，使酶在pH=6时的活力提高10倍。工业用酶最佳pH的改变预示着其可带来巨大的经济效益。,蛋白质结构和功能的关系,一、蛋白质结构和功能的关系 其关系是相互的蛋白质的结构是蛋白质功能的分子基础，蛋白质的结构特征决定了蛋白质的性质和功能。蛋白质的功能是蛋白质结构的具体体现。,二、结构相同的蛋白质具有不同的功能 趋异进化三、不同结构的蛋白质具有相同的功能 趋同进化结构与功能的复杂性：功能与蛋白的整体结构及局部关键位点有关,
