第一章酶学与酶工程.ppt

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1、第一章 酶学与酶工程,第一节 酶工程概述,1、酶学发展历史,新陈代谢是生命活动的基础,是生命活动最重要的特征。约公元前21世纪夏禹时代,人们就会酿酒。公元前12世纪周代已能制作饴糖和用豆类做酱。,1810年Jaseph Gaylussac发现酵母可将糖转化为酒精。1833年Payen和Persoz从麦芽得到淀粉酶制剂(diastase),其意思是“分离”。首先发现了酶。1878年,Kuhne才给酶一个统一的名词,叫Enzyme,希腊文意思是“在酵母中”。,1903年，Herlri提出了酶与底物作用的中间复合物学说。1913年Michaelis和Mentern导出了米氏方程,酶由定性到定量,奠定

2、了酶学发展的里程碑。,1926年美国科学家Sumner从刀豆提取出了脲酶并获得结晶,证明脲酶具有蛋白质性质。奠定了现代酶学、蛋白质化学的基础。萨姆纳,J.B.美国生物化学家 1946年诺贝尔化学奖,1958年，Koshland提出了“诱导契合”理论，以解释酶的催化理论和专一性。,1965年Phillips首次用X射线晶体衍射技术阐明了鸡蛋清溶菌酶的三维结构。,80年代初Cech和Altman分别发现了核酶(ribozyme),开辟了酶学研究的新领域,1989年共同获得诺贝尔化学奖。切赫T.R.Cech（1947）奥尔特曼S.Altman(1939-),1986年Schultz与Lerner等人

3、研制成功抗体酶(abzyme),这一研究成果对酶学研究具有重要的理论意义和广泛的应用前景。它集生物学、免疫学、化学于一身，采用单克隆、多克隆、基因工程、蛋白质工程等高新技术，开创了催化剂研究和生产的崭新领域。,Boyer和walker阐明了ATP合酶(ATP synthase)合成与分解ATP的分子机制,于1997年获得诺贝尔化学奖。ATP合酶的结构（引自Lodish等1999）,现已鉴定出4000多种酶,数百种酶已得到结晶。这些问题的提出和解决，都与酶学知识和理论的掌握有直接的关系。,2、酶工程简介,（1）酶工程的产生（2）酶工程的历史(3)酶工程研究内容,（1）酶工程的产生,生物工程学(b

4、iotechnology)也叫生物技术或生物工艺学,是20世纪70年代初在分子生物学和细胞生物学基础上发展起来的一个新兴技术领域。酶工程(enzyme engineering)是生物工程的主要内容之一。是酶学和工程学相互渗透结合、发展而成的一门新的技术科学。是酶学、微生物学的基本原理与化学工程有机结合而产生的边缘科学技术。,（2）酶工程的历史,1894年，日本科学家首次从米曲霉中提炼出淀粉酶，治疗消化不良，开创人类有目的地生产和应用酶制剂的先例。1908年,德国科学家罗门等利用胰酶(胰蛋白酶、胰淀粉酶和胰脂肪酶的混合物)，用于皮革的鞣制。1917年,法国人用枯草杆菌产生的淀粉酶作纺织工业上的退

5、浆剂。1949年,日本采用深层培养法生产-淀粉酶获得成功,使酶制剂生产应用进入工业化阶段。1959年,葡萄糖淀粉酶催化淀粉生产葡萄糖新工艺研究成功,大大地促进了酶在工业上应用的前景。,1953年，德国科学家首先将聚氨基苯乙烯树脂重氮化，然后将淀粉酶等与这种载体结合，制成了固定化淀粉酶。1971年，第一次国际酶工程学术会议在美国召开，会议的主题就是固定化酶的研制和应用。,20世纪70年代大规模开展了固定化细胞、辅酶共固定、增殖细胞固定、动植物细胞固定等研究。建立多种类型的酶反应器,酶工程蓬勃发展。近20年来，酶分子修饰技术、酶的化学合成以及酶的人工合成等方面的研究，也在积极地开展中，从而使酶工程

6、更加显示出广阔而诱人的前景。当然酶工程的研究不是孤立的,而是与各个学科相互关联、相互渗透、相互促进的。,(3)酶工程的内容,酶工程主要指酶制剂在工业上的大规模应用及其相应的研究，由以下部分组成:酶的生产；酶的分离纯化；酶的固定化；酶分子的改造和修饰 酶抑制剂的研究 生物反应器。,化学酶工程和生物酶工程,化学酶工程指自然酶、化学修饰酶、固定化酶及化学人工酶的研究和应用 生物酶工程是酶学和以基因重组技术为主的现代分子生物学技术相结合的产物,主要包括3个方面:用基因工程技术大量生产酶(克隆酶)修饰酶基因产生遗传修饰酶(突变酶)设计新的酶基因合成自然界没有的新酶,全世界著名的酶制剂企业有：丹麦Novo

7、zymes公司、美国杰能科国际公司（Genencor)。我国酶制剂工业诞生于1965年。现有100多家生产厂，最大的是无锡酶制剂厂。万吨以上企业有10家。品种有20多种，应用在食品、饲料、制革、洗涤剂、纺织、酿造、造纸、医药等许多行业。,使用的酶制剂类型:,一类是水解酶类 淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶、脂肪酶、果胶酶、乳糖酶等,占有市场销售额的75%以上。约有60%以上的酶制剂已用基因改良菌株生产,公司使用的菌种有80%是基因重组菌株。,二类是非水解酶 主要是分析试剂用酶、医药工业用酶、淀粉加工用酶、乳制品工业用酶,第二节 酶的分类、组成、结构特 点和作用机制,一、酶的分类（一）酶的命名法1、习惯

8、命名法(1)依据底物来命名（绝大多数酶）：蛋白酶、淀粉酶；(2)依据催化反应的性质命名：水解酶、转氨酶；(3)结合底物和催化反应的性质命名：琥珀酸脱氢酶；(4)有时加上酶的来源：胃蛋白酶、牛胰凝乳蛋白酶。,（二）国际系统命名基本原则：明确标明酶的底物及催化反应的性质（底物为水时可略去不写）。,举例：谷丙转氨酶的系统名称：丙氨酸:-酮戊二酸 氨基转移酶,丙氨酸：-酮戊二酸氨基转移酶,（三）国际系统分类法及编号（EC编号）（1）按反应性质分六大类，用1、2、3、4、5、6表示：氧、转、水、裂、异、合；,1：氧化还原酶 2：转移酶 3：水解酶 4：裂合酶 5：异构酶 6：合成酶(连接酶),（2）根据

9、底物中被作用的基团或键的特点，将每一大类分为若干个亚类，编号用1、2、3等；（3）每个亚类又可分为若干个亚一亚类，用编号1、2、3表示。,乙醇脱氢酶 EC1.1.1.1，第一个数字表示大类：氧化还原酶类第二个数字表示反应基团：醇基第三个数字表示电子受体：NAD+第四个数字表示此酶底物：乙醇。,前面三个编号表明这个酶的特性：反应性质、底物性质（键的类型）及电子或基团的受体，第四个编号用于区分不同的底物。,酶的编号由4个数字组成，中间以“”隔开。第一个数字表示大类，第二个数字表示亚类，第三个表示亚-亚类，第四个数字表示在亚-亚类中的编号。,二、酶的组成和结构特点（一）酶的化学本质 酶除了少数有催化

10、活性的RNA分子外,几乎所有的酶都是蛋白质。具有蛋白质的典型性质。同时具有自身的特性。,（二）酶的化学组成单纯酶类(simple enzyme)：仅由蛋白质组成，不含其它物质，如脲酶、溶菌酶、淀粉酶、脂肪酶、核糖核酸酶等。缀合酶类（conjugated enzyme)：全酶=脱辅酶+辅因子，二者存在酶才有催化作用；如超氧化物歧化酶（Cu2、Zn2）、乳酸脱氢酶（NAD+）,辅酶：与酶蛋白结合较松，可透析除去。如NAD+，NADP+辅基：共价键，与酶蛋白结合较紧，透析不可除去。如细胞色素氧化酶的铁卟啉,金属离子：Fe2+、Zn2+、Cu+、Cu2+、Mn3+、Mg2+、K+、Na+、Co2+等。

11、有机化合物：NAD+，NADP+，FAD，生物素，卟啉等,酶的辅因子主要有金属离子和有机化合物，并且根据与脱辅酶结合的松紧程度不同可分为两类，即辅酶和辅基。,1.单体酶一般是由一条肽链组成，大多是催化水解反应的酶。,牛胰RNase 124a.a 单链 鸡卵清溶菌酶 129a.a 单链,2.寡聚酶 由两个或两个以上亚基组成的酶，亚基可以相同或不同，一般是偶数，亚基间以非共价键结合。亚基一般无活性,必须相互结合才有活性。,如乳酸脱氢酶等。,3.多酶复合体由几个酶靠非共价键结合而成，其中每一个酶催化一个反应，所有反应依次进行，构成一个代谢途径或代谢途径的一部分。大肠杆菌丙酮酸脱氢酶复合体由三种酶组成

12、：,丙酮酸脱氢酶（E1）二氢硫辛酸转乙酰基酶（E2）二氢硫辛酸脱氢酶（E3）,（二）酶的结构特点1.有四级空间结构形式，寡聚酶必须具有正确的四级结构才有活性。2、具有活性的酶都是球蛋白,即被广泛折叠、结构紧密的多肽链,其氨基酸亲水基团在外表,而疏水基团向内。,三、酶的作用机制,（一）结合部位 Binding site酶分子中与底物结合的部位或区域一般称为结合部位。,（二）催化部位 catalytic site,酶分子中促使底物发生化学变化的部位称为催化部位。,酶的活性中心的概念 通常将酶的结合部位和催化部位总称为酶的活性部位或活性中心。结合部位决定酶的专一性，催化部位决定酶所催化反应的性质。,

13、酶的活性中心包括底物结合部位（决定酶的专一性）、催化部位（直接参与催化反应，形成产物）,酶的作用机制,酶结合底物分子,形成酶-底物复合物。酶活性部位的活性残基与底物分子结合,转变为过渡态,然后生成产物,释放到溶液中。游离的酶与另一分子底物结合后,开始它的又一次循环。（一）两种模型,1、锁和钥匙模型(lock-and-key model)1894年Emil Fischer,德国科学家。师从凯库勒。他发现了苯肼，对糖类、嘌呤类有机化合物的研究取得了突出的成就，因而荣获1902年的诺贝尔化学奖。,认为整个酶分子的天然构象是具有刚性结构的，酶表面具有特定的形状。酶与底物的结合如同一把钥匙对应一把锁一样

14、。,2、诱导契合模型(induced-fit model)1958年由Koshland 提出。认为酶表面并没有一种与底物互补的固定形状，而只是由于底物的诱导才形成了互补形状。,随后的X衍射分析实验结果支持这一假说,比较满意地说明了酶的专一性。(1)酶有其原来的形状,不一定一开始就是底物的模板。(2)底物能诱导酶蛋白分子形状发生一定的变化。(3)酶分子发生变化后就能与底物互补楔合。(4)在酶反应过程中,活性中心构象的变化是可逆的诱导契合学说认为:酶的活性部位在结构上是柔性的而非刚性的也就是说不固定的,即具可逆性和弹性。,（二）酶的作用机制,1、酸碱催化酶分子的一些功能基团起瞬时质子供体或质子受体

15、的作用。分为狭义的酸碱催化和广义的酸碱催化。狭义的酸碱催化剂即是H+与OH-广义的酸碱是指能供给质子(H+)与接受质子的物质。可作为广义酸碱的功能基团：氨基、羧基、巯基、酚羟基、咪唑基。,影响酸碱催化反应速度的两个因素：酸或碱的强度。组氨酸咪唑基的解离常数为6，在pH6附近（中性溶液）有一半以质子供体（酸）形式存在，另一半以质子受体（碱）形式存在。给出质子或结合质子的速度。其中，咪唑基给出质子和结合质子的速度十分迅速，是酶的催化反应中最有效、最活泼的一个功能基团。,2、共价催化酶的某些亲核基团，能迅速与底物形成共价中间复合物，降低反应的活化能，使反应加速。酶亲核基团：Ser-OH，Cys-SH

16、，His-咪唑基等 底物亲电中心：磷酰基（-P=O），酰基（-C=O），糖基（Glc-C-）,3、邻近效应及定向效应,邻近效应 底物的反应基团与酶的催化基团越靠近,其反应速度越快。定向效应 催化基团与底物的反应基团之间的正确取位，从而提高酶催化反应速度的效应。,4、变形或张力 当特异底物与酶结合时,酶蛋白发生一定构象变化,与底物发生诱导契合。酶使底物分子中的敏感键发生变形或张力。,底物形变，利于形成ES复合物。进一步转换成过渡态结构，大大降低活化能。,5、酶的活性中心为疏水区域,酶的活性中心常为酶分子的凹穴。此处常为非极性或疏水性的氨基酸残基。介电常数低,并排出极性高的水分子。这使得底物分子的

17、反应键和酶的催化基团之间易发生反应,有助于加速酶催化反应。,6、多元催化和协同效应,多个基元催化反应配合在一起共同起作用。上面介绍了实现酶反应高效率的几个因素,但是并不能指出那一种因素可以影响所有酶的全部催化活性。更可能的情况是：不同的酶,起主要影响的因素可能是不同的,各自都有其特点,可以受一种或几种因素的影响。,第三节 酶作为催化剂的显著特点,酶与化学催化剂比较具有显著的特性。最重要的有三方面:一、高催化效率 二、强专一性 三、酶活性可以调控,一、高催化效率,催化能力，酶加快反应速度可高达108-1020倍。,酶促反应速度相当高,而酶催化的最适条件几乎都为温和的温度和非极端pH。以NH3为例

18、：固氮酶：25、中性pH。工业：700900K、1090MPa,（一）酶专一性类型1、结构专一性,（1）绝对专一性 酶对底物的要求非常严格，只能对某一种底物的某一种反应起催化作用。脲酶只能催化尿素水解,而对尿素的各种衍生物或尿素的其它反应不起作用。,（2）相对专一性：对底物专一性降低，可作用一类结构相近的底物。,二、酶的专一性,基团专一性除了对键有要求，还对于键的一端的基团要求严格。例如：-D-葡萄糖苷酶不但要求-糖苷键,并且要求-糖苷键的一端必须有葡萄糖残基,而对键的另一端R基团则要求不严,因此它可催化含有-葡萄糖苷的蔗糖或麦芽糖水解,但不能使含有-葡萄糖苷的纤维二糖水解。,键专一性：作用于

19、一定的键,但对键两端的基团并无严格要求。这类酶对底物结构的要求低。酯酶催化酯键的水解,而对底物R-C中的R及R基团都没有严格的要求,即能催化水解甘油酯类、简单脂类,也能催化丙酰、乙酰胆碱等。,2.立体异构专一性 有些酶不仅对底物化学结构有要求,而且对底物分 子的立体构型也有要求,称作立体异构专一性。立体异 构专一性又分两类:(1)旋光异构专一性 当底物具有旋光性时,酶只能作用于其中的一种。它是酶反应中相当普遍的现象。例如：L-氨基酸氧化酶只能 催化L-氨基酸氧化,而对D-氨基酸无作用。,(2)几何（顺反）异构专一性 酶对底物的几何构型有严格的要求称之为几何异构专一性。例如：延胡索酸酶只能催化反

20、丁烯二酸（即延胡索酸），而不能催化顺丁烯二酸的水合作用。,三、调节性,酶活性的调节控制主要有下列7种方式 1.酶浓度的调节 两种方式：诱导或抑制酶的合成；调节酶的降解 例如：-半乳糖苷酶的合成。,2.激素调节 例：乳糖合成酶 乳糖合成酶由催化亚基和调节亚基组成，可以催化乳糖合成反应：EUDP-半乳糖+葡萄糖 乳糖+UDP,调节亚基合成是受激素控制的。,3.共价修饰调节 在一种酶分子上,共价地引入或去掉一个基团从而改变酶的活性 例：磷酸化酶的磷酸化和去磷酸化 4.限制性蛋白水解作用与酶活力调控 高特异性的共价修饰调节系统 例：酶原激活、血液凝固、补体激活,5.抑制剂的调节 例：胰脏的胰蛋白酶 抑

21、肽酶,磷酸变位酶 2,3-二磷酸甘油酸6.反馈调节 许多小分子物质的合成是由一连串的反应组成的。催化此物质生成的第一步反应的酶,往往可以被它的终端产物所抑制,这种对自我合成的抑制叫反馈抑制。例：异亮氨酸抑制第一个酶一苏氨酸脱氨酶 7.金属离子和其他小分子化合物的调节,第四节 影响酶活性的因素,一、酶速度,酶催化反应的速率通常称作酶速度(velocity)。酶速度通常以酶促反应的初速度为准(底物消耗5%）。因为底物浓度降低、酶部分失活、产物抑制和逆反应等因素，会使反应速度随反应时间的延长而下降。,几个概念,酶的活力单位：表示酶活力大小所用的两个国际单位1IU：在最适反应条件下，每分钟催化1mol

22、底物转化为产物所需的酶量，称一个IU。1 Kat：在最适反应条件下，每秒钟催化1mol底物转化为产物所需的酶量，称Kat单位 1 Kat60 106 IU；1 IU 1/60 Kat16.7n Kat最适条件：最适温度（25或37）,最适pH、最适缓冲液离子强度、最适底物浓度。底物浓度要求：（1）通常很大，使酶饱和；（2）底物消耗5%。,酶活力(或总活力):样品中酶的总单位比活力:是每毫克蛋白质中酶单位的数量(U/mg)。比活力=活力U/mg蛋白=总活力U/总蛋白mg,影响酶活力的因素1、底物浓度酶速度对底物浓度(S)的依赖关系的正常模式是：在低的底物浓度下,S增加1倍,将导致起始速度(Vo)

23、也增加1倍。在较高底物浓度下,酶被饱和,进一步增高S,只导致Vo的微小变化。进一步加入底物对酶速度也将不发生影响。Vo对S的关系图形称为双曲线(hyperbolic curve),2、酶浓度在底物浓度饱和的情况下(即所有酶分子都与底物结合),酶浓度的加倍将导致Vo的加倍。Vo与酶浓度的关系图为直线图形。,3、温度的影响一方面是温度升高,酶促反应速度加快。另一方面,温度升高,导致酶活性降低甚至丧失。大多数酶都有一个最适温度。在最适温度条件下,反应速度最大。最适温度不是酶的特征物理常数,也不是固定值,而与酶作用时间的长短有关。生物不同生长阶段有不同的最适温度。,4、pH,每个酶都有最适pH,在此p

24、H下催化反应的速率是它的最高值。（1）最适pH有时因底物种类、浓度及缓冲液成分不同而不同。（2）酶的最适pH并不是一个常数,只是在一定条件下才有意义。pH影响酶活力的原因可能有以下几个方面:(A)过酸,过碱会影响酶蛋白的构象,甚至使酶失活。(B)影响底物分子的解离。(C)pH影响酶分子的解离,而这些基团的离子化状态与酶的专一性及酶分子中心活力中心的构象有关。,第五节 酶动力学和抑制作用,一、米-曼氏模式,1、Michaelis-Menten 方程的建立,米氏方程,2、米氏常数的意义,Km：米氏常数，物理意义为反应速率为最大速率Vmax一半时底物的浓度，单位与底物浓度同（1）Km是酶的一个特性常

25、数，Km大小只与酶性质有关，而与酶浓度无关。当底物确定，反应温度，pH及离子强度一定时，Km值为常数，可用来鉴别酶。,Km一般在110-610-1mol/L之间不同的酶Km值不同，测定Km要在相同测定条件（pH、温度、离子强度）下进行。,（2）Km值可用于判断酶的专一性和天然产物，若一个酶有几种底物就有几个Km值，其中Km值最小的底物称为该酶的最适底物，又称天然底物。（3）可近似表示酶与底物亲和力的大小。真正表示酶与底物亲和力为Ks=k2/k1(注 Km=k2+k3/k1)（4）已知Km可由S计算v，或由v计算S。,二、Lineweaver-Burk作图,y=ax+b纵轴截距：1/Vmax；横

26、轴截距：-1/Km；斜率：Km/Vmax。,三、酶的抑制作用,抑制作用：酶的必需基团的化学性质改变而引起酶活力降低或丧失，但不引起酶蛋白变性。凡能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白变性的物质称为酶的抑制剂。意义：研究酶的抑制剂，可以研究酶的结构与功能、酶催化机制，进行药物、农药的设计与筛选。,（一）抑制作用的类型：1.不可逆抑制作用Irreversible inhibition 2.可逆性抑制作用Reversible inhibition 1)竞争性抑制 Competitive inhibition 2)非竞争性抑制 Non-competitive inhibition,有机磷化合物,羟基酶,失

27、活的酶,酸,1、不可逆抑制作用 这类抑制剂通常以共价键与酶蛋白中的基团结合，从而使酶活性降低，甚至丧失。不能用透析、超滤等物理方法除去这些抑制剂，使酶活性恢复。举例有机磷化合物 羟基酶解毒-解磷定(PAM),2.可逆性抑制作用 抑制剂通常以非共价键与酶可逆性结合，使酶的活性降低或丧失；抑制剂可用透析、超滤等方法除去。类型 竞争性抑制 非竞争性抑制,）竞争性抑制作用,反应模式,定义抑制剂与底物的结构相似，能与底物竞争酶的活性中心，从而阻碍酶底物复合物的形成，使酶的活性降低。这种抑制作用称为竞争性抑制作用。,*特点,充分的高底物浓度可以将结合到活性部位的抑制剂分子竞争地排出，因此酶的Vmax不变，

28、但在竞争性抑制剂存在下，酶对其底物的亲和力降低，因此Km增大。,I与S结构类似，竞争酶的活性中心；,2)非竞争性抑制 底物和抑制剂同时和酶结合,两者没有竞争作用。酶活力降低 如Leu是精氨酸酶非竞争性抑制剂。,*特点,抑制剂与酶活性中心外的必需基团结合，底物与抑制剂之间无竞争关系；,抑制程度取决于抑制剂的浓度；,非竞争性抑制剂的效应不能由增高底物浓度而克服，所以Vmax降低，酶对底物的亲和力不变，因此Km不变。,第六节 蛋白质、酶和重组 蛋白质的分离纯化,一、蛋白质纯化的一般考虑,分离纯化用的原料来源要方便,成本要低;目的蛋白质含量、活性相对要高 条件要尽可能十分温和 审慎地思考,避免随意性

29、建立灵敏、特异、精确的检测手段,评估纯化方法 纯化策略的选择,（一）材料的选择,天然材料：早期酶制剂多是从动植物中提取。但动植物原料生长周期长、成本高，又受地理、气候和季节等因素影响。基因工程材料：对于天然不易得到的蛋白，目前通过工程菌或工程细胞表达而获得。工业用酶多采用微生物发酵生产。,二、酶的分离和纯化,微生物发酵,目前工业应用酶大多数来自微生物，这是因为以微生物为生产原料有许多优点。微生物种类繁多；产酶微生物多；一种微生物可以产多种酶；微生物繁殖快、生产周期短、培养方便；微生物易改造，可通过多种手段进行育种。,酶的发酵生产,酶的生产菌 先决条件，直接影响发酵的生产成本。对生产菌的要求：非

30、病源菌，同时在系统发育上与病原菌无关，不产毒素及其他生理活性物质；产酶量高，最好分泌胞外酶；生产菌稳定，不易变异、退化、不易感染噬菌体；容易培养，能利用廉价原料，发酵周期短。,生产菌的获得,采样 分离 筛选 诱变；采样：在富含该酶作用底物的场 所采样；在与酶活性最适条件相的 环境采样；分离：平板划线法、直接稀释法.筛选：初筛、复筛；向菌种中心购买或索取。,中国国家级菌种保藏管理中心（7个）,名称及成立年份 依 托 单 位 中国农业微生物菌种保藏管理中心 中国农业科学院土壤肥料研 究所(ACCC)1980 中国工业微生物菌种保藏管理中心 中国食品发酵工业研究院(CICC)1979 中国医学微生物

31、菌种保藏管理中心 中国药品生物制品检定所(CMCC)1979 中国兽医微生物菌种保藏管理中心 中国兽医药品检定所(CVCC)1979 中国林业微生物菌种保藏管理中心 中国林业科学研究院(CFCC)1985 中国抗菌素菌种保藏管理中心 中国医学科学院医药生物技 术研究所(CACC)1979 中国普通微生物菌种保藏管理中心 中国科学院微生物研究所(CCGMC)1979,国外菌种中心,American Type Culture Collection http:/www.atcc.orgJapan Collection of Microorganisms http:/www.jcm.riken.go.

32、jpThe United Kingdom National Culture collection http:/www.ukncc.co.ukDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen http:/www.dsmz.de,ATCC 美国菌种中心，最大的菌种中心,有病毒、细菌、真菌、细胞等不同的微生物JCM 日本微生物菌种中心英国国家菌种中心，Over 70,000 micro-organisms and cell lines are available.德国微生物与细胞收集中心,主要产酶菌,大肠杆菌：应用最广泛的产酶菌，一般分泌胞

33、内酶。因为其遗传背景清楚而广泛应用于遗传工程改造微生物的宿主，被改造成表达优良性状的“工程菌”。也常在工业生产中应用于生产谷氨酸脱羧酶、门冬氨酸酶、限制性核酸内切酶等。枯草杆菌：工业上应用最广泛的产酶菌之一，淀粉酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酯酶等的产酶菌。啤酒酵母：工业上广泛应用，主要产转化酶、醇脱氢酶、丙酮酸脱羧酶等。曲酶（黑曲酶和黄曲酶）：糖化酶、蛋白酶、果胶酶、氨基酰化酶、葡萄糖氧化酶、淀粉酶、氨基酰化酶、脂肪酶等多种酶。,提高酶产量的方法,条件控制：优化发酵条件，包括培养基：碳源、氮源、无机盐和生长因子、pH值、温度、溶解氧、发酵周期等；添加诱导物、降低阻遏物浓度。遗传控制：物理、化学法

34、诱变育种；基因重组构建工程菌。,（二）细胞破碎,细胞壁的主要成分：细菌：肽聚糖：N-乙酰萄糖胺，N-乙酰 胞壁酸 真菌和酵母：萄聚糖，甘露聚糖 藻类：纤丝状多糖类细胞破碎的方法：1）机械法 2）物理法 3）化学法 4）生物法（酶解）,1.机械法：1）液体剪切：搅拌、匀浆。2）固体剪切：研磨，珠磨，捣碎。2.物理法：1）超声波：通过剪切力和空穴作用（30mg蛋白/ml,30-60sec/次）2）渗透压突变：高渗（蔗糖，高盐 等）平衡后迅速转入低渗溶液或水。3）冻融：反复低温冰冻，室温融化。4）冷冻干燥，再溶剂抽提。,3.化学法：1）有机溶剂处理：溶解膜脂，干燥，抽提。2）表面活性剂处理，改变膜通

35、透性，使之溶解，再提膜蛋白。常用 Triton-X100等。4.酶解法：应用溶菌酶，糖苷酶，萄聚糖酶，甘露 聚糠酶，纤维素酶等分解细胞壁。,（三）酶的粗分离,1.离心分离,原理：当物体围绕一中心轴做圆周运动时，运动物体就受到离心力的作用。旋转速度越高，运动物体所受到的离心力越大。如果装有悬浮液或高分子溶液的容器进行高速水平旋转，强大的离心力作用于溶剂中的悬浮颗粒或高分子，会使其沿着离心力的方向运动而逐渐背离中心轴。在相同转速条件下，容器中不同大小的悬浮颗粒或高分子溶质会以不同的速率沉降。经过一定时间的离心操作，就有可能实现不同悬浮颗粒或高分子溶质的有效分离。,离心转速：低速离心机2000600

36、0r/min，高速离心机1800025000r/min，超速离心机 4000080000r/min,实验室离心机,温度类型：常温及冷冻超速离心机均为冷冻型。使用冷冻离心机时提前降温，预冷离心头，开盖关机。使用超速离心机时先抽真空。,离心的形式,角式及外摆式：外摆式一般为低速，角式由低速到超速均有。,角式离心机和离心头（转子）,角式离心头要配套，低温使用要预冷，操作注意稳、盖、胶圈、旋紧。,离心机的大小：落地式及台式,离心机操作,平衡、定温、定速、定时、定刹车。,离心机其他类型,超速冷冻离心机,立式螺旋过滤离心机,活塞推料离心机,离心机（连续式）,(1)蛋白质的盐溶与盐析盐溶：是指在适当的中性盐

37、浓度溶液中，蛋白质溶解度会提高的现象，称盐溶。盐析：向蛋白质溶液中加入大量中性盐（高盐浓度）时，会破坏蛋白质分子表面的水化层（即破坏了蛋白质在水溶液的稳定性因素）导致蛋白质的溶解度降低发生沉淀析出，称盐析。常用的饱和硫酸铵沉淀法分离纯化蛋白质就是利用盐析的原理，不同的蛋白质对饱和硫酸铵的要求不同，所以，可以通过饱和硫酸铵的分级沉淀法分离各种蛋白质。,2.浓缩技术,盐析的影响因素,1）pH：等电点处最易沉淀。2）蛋白质浓度：过稀回收沉淀困难，过浓易共沉淀，2.5%-3%最好。,盐析操作,低饱和度：饱和溶液滴加法。易于迅速混合均匀，一般终饱和度不超过40。高饱和度：固体盐添加法。不会大量增加溶液体

38、积。温和搅拌中缓慢加盐。加毕继续搅拌10分钟以上，以充分沉淀。沉淀后需高速离心。沉淀再溶解后可能需要除盐。,(2)聚乙二醇沉淀,原理：1）聚乙二醇可与蛋白质分子形成复合物，除去水分子外壳，导致沉淀。2）空间排阻学说：聚乙二醇在溶液中形成网状结构，与蛋白质分子发生空间排挤作用，使之沉淀。,聚乙二醇沉淀影响因素,1）蛋白质分子量越大越易沉淀，即a值越大，沉淀所需聚乙二醇浓度越低。2）不能浓度太大，一般不超过10mg/ml。3）温度在20 分辨率最高，030可应用。4）聚乙二醇聚合度高易使蛋白沉淀，但因粘度影响操作，多采用聚乙二醇6000。5）2.5以下离子强度，等电点附近pH为好。,(3)有机溶剂

39、沉淀,在待分离的酶液中加入与水互溶的有机溶剂使溶液介电常数降低，酶蛋白分子间引力增大而相互产生聚集，从而降低溶解度而析出沉淀。实际操作中常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇和甲醇等。温度 0下操作。有机溶剂先在-15-20下预冷，沉淀后立即在低温下离心分离。pH=pI 沉淀后马上用缓冲液溶解，减少有机溶剂浓度。,三、细分离与纯化（一）大规模层析技术,层析系统,KTA purifier-high performance,KTA FPLC,Waters 2690,常压层析系统,中压层析系统,高压层析系统,HP 1100,层析装置 梯度混和器，蠕动泵，层析柱，监测仪，记录仪，收集器,层析柱,记录仪,低

40、温层析柜,层析操作流程,处理介质装柱平衡上样洗脱介质再生,根据分子量大小范围选择凝胶。颗粒细的分辩率高,流速慢；粗的分辩率低,流速快。,装柱均匀，不能有气泡。,用缓冲液平衡，直到基线稳定。,按柱床体积2-5%上样。,以一定流速，用缓冲液洗脱，收集目标蛋白。,按照水-稀碱-水洗涤，为防止微生物生长，保存0.02%NaN3或20%乙醇中，注意NaN3可能抑制目标酶。,1、凝胶过滤层析（分子筛层析）是根据分子大小分离蛋白质混合物的最有效方法之一。,原理:当不同分子大小的蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外随着溶剂在凝胶珠之间的孔隙向下移动并最先流出柱外

41、;比网孔小的分子能不同程度地自由出入凝胶珠的内外。这样由于不同大小的分子所经的路径不同而得到分离,大分子物质先被洗脱出来,小分子物质后被洗脱出来。,凝胶过滤常用的介质：在层析柱内装填带有小孔的凝胶颗粒。交联葡聚糖（Sephadex，是由葡聚糖与环氧氯丙烷交联形成的有三维空间的网状结构物）。聚丙烯酰胺凝胶琼脂糖凝胶,2、离子交换层析,基本原理 离子交换树脂共价连接有可解离基团，可人为选择性地使其带上电荷，带正电荷的为阴离子交换树脂，带负电荷的为阳离子交换树脂。生物大分子表面带电荷，通过静电键可结合在相应的树脂上。亲和力大小取决于可形成的静电荷数目，及排布方式有关，不同大分子会有不同亲和力。改变环

42、境的离子强度或pH值使表面电荷变化，会改变相应亲和力，从而改变大分子在树脂上的吸附状态，达到分离目的。,洗脱方法,1）增加缓冲液离子强度，既增大离子在树脂上的竞争，同时减少大分子表面电荷，降低吸附力，从而使大分子由树脂上解析。2）改变pH，减少蛋白分子表面解离基团的解离度，降低吸附力，从而使大分子解析。但改变过多可能使蛋白变性。有时两种方法可以结合使用。,洗脱方式,1）梯度洗脱 洗脱液的离子强度或pH连续改变，使混合物中各个蛋白先后进入有限吸附至不吸附状态而被洗脱。注意：总体积要足够大，使各分离峰不太拥挤；梯度上限要足够高，使各物质都能解析；梯度斜度适当，过大各峰不易分开，过小使峰形过宽和拖尾

43、。,2）阶段洗脱 用不同离子强度或pH的洗脱液按洗脱能力由小到大相继进行洗脱。优点：洗脱峰集中，体积小浓度高；所需洗脱液总量少，时间短；设备和操作简单。缺点：洗脱峰纯度可能不够高；洗脱峰经常有拖尾；变一次洗脱液就会有一个峰，有时一个成分二个峰，造成假象。,两种离子交换剂,阴离子交换剂：带正电荷，吸附带阴离子的大分子，交换原吸附的小分子阴离子。常用二乙氨基乙基，二乙氨基乙基2-羟丙基,阳离子交换剂：带负电荷，吸附带阳离子的大分子，交换原吸附的小分子阳离子。常用羧甲基，磺丙基,3.亲和层析,亲和层析：利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力，建立起来的一种有效的纯化方法。配基：酶的底物、辅酶、抑制

44、剂、效应物及其结构类似物，激素与受体蛋白，抗原与抗体等。亲和层析的原理：亲和层析树脂上接有特定的生物大分子配基，可专一地结合特定生物大分子。变换洗脱条件时，即可将该分子洗脱，实现分离提纯。,亲和层析的原理,4、高效液相层析(HPLC),HPLC纯化蛋白质的报告大多局限于实验室规模(数毫克到数十毫克)Waters公司的HPLC已备有大规模制备的层析柱。将亲和层析的高分辨力和HPLC的快速结合,高效液相层析法的基本概念和分离理论与经典的液相色谱法及气相色谱法一致。高效液相层析仪 典型的高效液相层析仪包括输液系统、层析柱与检测系统三部分。流动相用高压泵输入。,一般用微量注射器直接进样，也可采用六通阀

45、门进样。HPLC中所用的检测器最多应用的是紫外吸收检测(UV)，灵敏度可达ng水平。此外，还有荧光检测器、示差析光检测器、电化学检测器等。,高效液相层析仪的结构简图,（二）大规模电泳技术,三个优点:处理样品的速度高,每小时可达1g;产品纯度高(一般能达到均一状态);回收率高,大于95%。,常用的电泳种类,区带电泳：在支持物上电泳时，蛋白质混合物被分离成若干区带。凝胶电泳：凝胶有分子筛效应，可更好分离。如常用的聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。等电聚焦电泳：,等电聚焦,（1）基本原理 根据蛋白质分子的等电点进行分离。利用这种技术分离蛋白质混合物是在具有pH梯度的介质中进行，在外加电场作用下，各种蛋白质将移向并聚集（停留）在等于其等电点的pH梯度处，并形成一个很窄的区带。（2）优点及主要用途 加样位置和体积不受严格限制，分辨率很高，可测定pI，分离速度快，分离的蛋白质不变性。可用于蛋白质和两性分子的分离分析和蛋白质pI的测定。（3）基本操作1、胶的制备(需两性电解质）2、加样和电泳 3、染色和脱色,酶制剂的价格与其活力及纯度有很大关系。大规模使用的酶纯度很底，价格便宜，可以大批购到。纯度很高的酶价格较为昂贵，与工业用酶相比，他们使用量较少，在制备时需使用纯化技术和高劳务费用。某些特定的研究用酶，他们的使用量有限，酶活力对环境要求严格，因此往往需要特制，价格极其昂贵。,