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1、家畜螭病诊断与防控技术规范1范围本文本文件规定了家畜蜻病诊断与防控技术规范。本文件适用于5类家畜(牛、羊、猪、兔、马)蜻病诊断与防控技术规范。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法NY/T393-2020绿色食品农药使用准则NY/T5030-2016无公害农产品兽药使用准则NY/T473-2016绿色食品畜禽卫生防疫准则NY/T472-2013绿色食品兽药使用准则3术语和定义下列术
2、语和定义适用于本文件。3.1疥螭(.Sarcoptesscabie)一种寄生于家畜(主要危害牛、羊、猪、兔和马)皮肤表皮层内的外寄生虫，虫体较小，乳白色，呈近圆形或龟形，背面隆起似半球形，腹面扁平，可引起家畜的疥炳病，参见附录。3.2绵羊痒螭Psoroptesovis一种寄生于家畜(主要危害牛、羊、兔和马)皮肤表面的外寄生虫，其成蛾个体较疥螭大，肉眼可见，呈长圆形，可引起家畜的痒蛾病，参见附录。3.3牛足螭(Chorioptesbovis)和XX足螭(.Chorioptestexanus)两种寄生于家畜(主要危害牛、羊和马)皮肤表面的外寄生虫，其形态与痒螭相似，呈卵圆形，可引起家畜的足螭病，参
3、见附录。3.4疥螭病(Sarcoplicmange)由疥螭(Sarcoptesscabiei)寄生于家畜皮肤表皮内引起相应的临床症状的外寄生虫病。3.5痒蜻病(PSOroPtiCmange)由绵羊痒蛾（Psoroptesovis）寄生于家畜皮肤表面引起相应的临床症状的外寄生虫病。3.6足螭病（ChOroPtiCmange）由足螭属（ChOrioP心）的蛾虫（主要包括牛足蛾和XX足螭）寄生于家畜皮肤表面引起相应的临床症状的外寄生虫病。4诊断4.1流行特点4.1.1 易感动物疥蛾主要危害牛（黄牛、耗牛和水牛）、羊（绵羊和山羊）、猪、兔和马；绵羊痒螭主要危害牛（黄牛、耗牛和水牛）、羊（绵羊和山羊）、
4、兔和马，牛足蛾和XX足螭主要危害牛（黄牛、奶牛、耗牛和水牛）、羊（绵羊和山羊）和马。4.1.2 传染源与传播途径感染有疥螭科（Sarcoptidae）和痒蛾科（PSOroPtidae）蛾虫的动物是传染源，主要通过患病动物和健康动物的直接接触而感染，其次可通过与被患病动物的病原所污染的畜舍、畜栏、场地、各种饲养用具等间接接触而感染，还可通过饲养员的衣服和手把蛾虫传播给健康动物。4.2临床症状4.2.1疥蜻病家畜疥蛾病主要以剧痒，皮肤脱毛、增厚、弹性降低和畜体消瘦为主要临床特征。家畜感染疥蛾后，常因家畜种类差异及家畜机体免疫水平的不同，各种家畜的皮肤损伤及随后的病程发展和临床症状可表现出一定的差异
5、（见附录B）o4.2.2痒蜻病家畜痒蛾病主要以瘙痒、结痂、皮肤增厚和消瘦为主要临床特征。家畜感染绵羊痒螭后，因宿主不同可表现出不同的临床症状和皮肤损伤（见附录C）。4.2.3足蜻病家畜患足螭病后患处脱毛，皮肤发红、增厚、发痒、结痂，特别是在家畜营养状况和养殖条件差时症状更加明显。家畜感染足螭后，因家畜种类的不同其所表现的临床症状也稍有差异（见附录D）。4.3实验室检查（见附录E）4. 3.1显微镜检测采集的痂皮经适当的处理后镜检发现螭虫虫体和/或虫卵。5. 3.2血清学检测酶联免疫吸附试验（ELJSA）法检测家畜血清中IgG抗体阳性。4. 3.3分子生物学检测聚合式酶链反应（PCR）检测到结痂
6、中蛾虫的核酸。4.4结果判定4.4.1疑似患病动物符合或阳性判定为疑似疥蛾病；符合或阳性判定为疑似痒蛾病；符XX性判定为疑似足螭病。4.4.2确诊患病动物符合或阳性判定疥螭病患病动物；符XX性判定痒蛾病患病动物；符XX性判定足蜻病患病动物。5预防控制5.1 患病家畜的防治5.1.1 治疗患病家畜使用杀蛾药物（阿维菌素、伊维菌素、多拉菌素、二嗪农、巴胺磷、鼠戊菊酯和双甲眯等）进行治疗，肉用或乳用家畜使用杀蛾药物时要严格注意其休药期。5.1.2 环境的杀螭处理治疗家畜的同时，还需要采用外用杀蛾药对圈养家畜笼舍及运动场等外环境进行杀螭处理。5.1.3 病死家畜的处理的发病死亡家畜要进行严格的无害化处
7、理，防止病原扩散。5.2 预防保持家畜厩舍（笼舍）清洁干燥、通风、透光、不拥挤。放牧家畜定期用杀螭药物进行药浴、投喂口服杀蛾药物或采用浇泼剂处理，定期用杀蛾剂喷洒厩舍（笼舍）和饲养用具。对小型笼舍可用火焰杀螭处理。螭病的常发地区，定期对家畜进行检查，一旦发现可疑家畜，立即隔离治疗。新引进的家畜，隔离观察1530天，确诊无螭后方能合群。肉用或乳用家畜使用杀螭药物进行预防时要严格注意其休药期。兽医和饲养人员接触患病家畜时应进行严格的安全防护，预防人体感染。附录A（资料性）病原学A.1形态A.1.1疥螭(Sarcoptesscabiei)分类上属于疥螭科（Sarcoptidae）的疥螭属（Sarco
8、ptes）,为雌雄异体，虫体可分为假头和躯体两部分，身体上有横、斜的皱纹。假头位于虫体前端，短而宽，有一呈蹄铁形的咀嚼式口器。虫体背面前端有一几丁质胸甲，呈长方形；末端正中有一肛门；两侧有对称的刚毛；体表有大量的波状皮纹、三角形鳞片、棒状刺。虫体腹面有4对粗短、呈圆锥形的足；前2对足向前伸，比后足长，可从背面看见，位于虫体前1/3；后2对足伸向后方，短，从背面不能见到，位于虫体后1/3（见图A.1、图A.2）。雄螭：虫体大小为200300微米X150200微米，第1、2、4对足上有吸盘，第3对足上仅有一根长刚毛；生殖孔位于虫体第4对足之间，周围有呈倒“V”字形的几丁质构造。雌螭：虫体大小为30
9、0500微米x250400微米。第1、2对足上有吸盘，第3、4对足上各有一-根长刚毛；生殖孔（产卵孔）位于虫体腹面中央，近末端有一阴道。图A.1疥螭（成螭）背面观图A.2疥螭（成年雌螭）腹面观A.1.2绵羊痒螭(PsoroptesOViS)分类上属于痒螭科（Psoroptidae）的痒螭属（PSOrOPteS）的螭虫，其成螭虫体大小500900微米x200520微米，肉眼可见，虫体可分为假头和躯体两部份。假头位于虫体前端，其基部背面后方无粗短垂直刚毛，由呈圆锥形的刺吸式口器，较长。躯体背面表皮有细皱纹；虫体透明的淡褐色角皮上有稀疏的刚毛和细皱纹。肛门位于躯体末端。足较长，特别是前两对足较后两对
10、足粗大。雄螭：第1、2、3对足上有吸盘，吸盘位于分三节的柄上，第4对足特别短，无刚毛和吸盘。躯体末端有两个大结节，上有长刚毛数根；腹面后部有两个吸盘；生殖器居于第4基节之间。雄螭有性吸盘和尾突（见图A.3）。雌蛾：第1、2、4对足上有吸盘，第3对足上各有两根长刚毛。躯体腹面前部有一个宽阔的生殖孔，后端有纵裂的阴道；躯体末端为肛门（见图A.4）。图A.3绵羊痒螭（雄蜻）腹面观图A.4绵羊痒螭（雌螭）背面观A. 1.3足螭(ChoriOPteS)分类上属于痒蜻科（PSOrOPIidae）的足螭属（ChoHoPteS）的螭虫，其成螭体长300微米500微米,虫体分为假头和躯体两个部分。假头由背面的1
11、对鳌肢、1对须肢和1个口下板组成。虫体体表有细纹；口器较短，呈锥形；足长，跑节吸盘的柄短而不分节；肛门位于虫体末端（见图A.5）。雌螭：4对足，第1、2、4对足上有吸盘，第3对足上有刚毛。雄螭：4对足，第1、2、3、4对足上均有吸盘，第4对足极短，从背面不能被看见。生殖孔位于第3、4对足之间。体末端有2个结节，结节的前方腹面有1对环状性吸盘，性吸盘上有刚毛。图A.5足螭（雌螭）背面观附录B（资料性）疥螭病临床症状B. 1牛皮肤病变常见于肩部、颈背部、尾根部、臀部、头部及四肢，严重时可波及全身。8. 2羊绵羊：始发于嘴唇四周、角两侧、鼻边缘和耳根部，严重时蔓延至整个头部及颈部，其中以头部出现症状
12、最明显。病变部可形成坚硬的灰白色痂皮，故俗称“石灰头”。山羊：多发生在被毛稀疏的皮肤，如嘴唇四周、眼圈、鼻梁和耳根部，严重时可蔓延到腋下、腹下和四肢曲面，甚至全身。病羊出现烦燥不安、剧痒，被毛脱落，病变部位逐步向四周延伸、扩大，皮肤增厚，形成皱褶和龟裂。8.3 猪各种年龄和品种的猪均可感染，临床症状主要表现为两种类型：皮肤过敏反应型：常见于乳猪和保育猪，主要是由螭虫引起的迟发型和速发型超敏反应。常起始于眼周、颊部和耳根，后要延至背部、躯干两侧、后肢内侧及全身。病猪出现剧痒，到处摩擦或以蹄搔弹患部，至摩擦部出血，患部脱毛、结痂、皮肤增厚，形成皱褶和龟裂。皮肤角化过度型：又称为慢性疥螭病，常见于经
13、产母猪、种公猪和成年猪。由于出现皮肤过度角质化和结缔组织增生，病猪皮肤变厚，形成大的皮肤皱褶、龟裂、脱毛，被毛粗糙多屑，常见成年猪耳廓内侧、颈部周围、四肢下部，尤其是踝关节处形成灰色、松动的厚痂，经常用蹄搔痒或在墙壁、栏栅上摩擦皮肤，造成脱毛和皮肤损坏、开裂和出血。8.4 兔皮肤病变常发于四肢，后蔓延至嘴及鼻周围等处。8.5 马皮肤病变始发于头部、体侧、躯干及颈部，后蔓延至肩部、髻甲及全身。附录C（资料性）痒螭病临床症状C. 1牛黄牛、奶牛和耗牛：患牛临床上皮损区皮肤发红，皮损区出现淡黄色的结痂，中等感染病例出现鳞状皮屑；皮损区多出现在尾根、背部和肩胛部，严重病例皮损区可蔓延到全身。患牛奇痒，
14、常在木柱等物体上摩擦，或用舌舔吮患部，皮肤损伤，脱毛，渗出液凝固形成痂皮。皮肤增厚，失去弹性。水牛：水牛的痒螭病发病部位、临床症状与黄牛、奶牛和耗牛的痒蛾病相似，但形成的痂皮较薄，呈“油漆起爆”状，痂皮薄似纸，表面平整，一端稍微翘起，另一-端则与皮肤紧贴。若揭开痂皮，可见许多仍在爬动的黄白色的螭虫。C.2羊绵羊：初始发于背部和臀部，后很快地蔓延到体侧。初期，患羊呈现轻度至中度瘙痒，表现为晃头、后肢搔抓患部、在木柱、墙壁等处擦痒，皮损区形成结节，后形成浅黄色脂肪样的痂皮；随病程加重，瘙痒加剧，患羊体上的毛结成束或躯体下部泥泞不清洁，后零散的毛丛悬垂在羊体上，最后毛束逐渐地大片脱落，甚至全身脱光。
15、病羊呈现贫血症状，高度营养障碍，在寒冷季节，加上皮肤脱毛，可引起绵羊的大批死亡。山羊：多发生于耳壳内面。病羊食欲不佳，常摇动耳朵；病变部发痒，常在硬物上摩擦。患部形成硬而坚实、紧贴皮肤的黄白色痂皮块，炎症常蔓延至外耳道。C.3兔兔患病时主要发生在外耳道内，可引起猛烈的外耳道炎；盯酢过盛分泌，干涸成痂，厚厚地嵌在耳道内如纸卷样，甚至完全堵塞耳道；耳变重下垂；病变部发痒，病兔摇头，搔耳；还可能延至筛骨及脑部，引起癫痫发作。G4马常发生于鬃部、鬣部、尾部、颌间部、股内侧及鼠蹊部。患部盖有浅黄色脂肪样的柔软痂皮，容易剥离。邻近的皮肤亦迅速脱毛。乘马及挽马常发生于装置鞍具、颈套、鞍樨的部位。附录D（资料
16、性）足螭病临床症状D. 1牛牛（黄牛、奶牛、牝牛和水牛）常初始发于尾根部和尾根部两侧的凹槽，皮损处覆盖干燥的细白色鳞片，皮损区发痒，后皮损区可蔓延到会阴、大腿内侧，甚至蔓延到箴部和背部或乳房；严重病例，在皮损区呈现厚的结痂，瘙痒明显。D. 2羊绵羊：主要寄生于绵羊的蹄部及腿外侧山羊：主要寄生于山羊的颈部、耳及尾根等处。D.3马马的足蛾寄生于马的肛周皱褶、后肢远端及尾部等处。附录E(规范性)实验室检查E.1显微镜检测E.1.1痂皮的采集E.1.1.1疥螭病痂皮的采集剪去患部和健康部皮肤交界处的毛后，采用经火焰消毒后的小刀垂直于皮肤面用力刮取交界处痂皮，直至刮处皮肤微有出血痕迹，刮破处涂碘伏消毒，
17、将刮取物收集到容器内，待检。E.1.1.2痒螭病与足螭病痂皮的采集用镜子夹取患病部皮肤表面的痂皮或者用消毒小刀用力刮取患病部皮肤表面的痂皮,取痂皮处涂碘伏消毒，将痂皮收集到容器内，待检。E.1.2镜检E.1.2.1热源发将采集的痂皮放入平皿内，将平皿放入2537C的恒温箱中0.5lh后,将平皿置于显微镜下检查，若检测到蛾虫和/或蜻卵则判定为阳性。E.1.2.2直接图片检查法将采集的痂皮放置于载玻片上，滴加1滴5%甘油(丙三醇)水溶液，加盖载玻片，搓压玻片至病料散开，分开载片，加盖片后置显微镜下检查，若检测到蜻虫和/或蜻卵则判定为阳性。E.1.2.3浓集法当蛾虫数量较少时，可采用浓集法收集螭虫镜
18、检。将刮取的较多痂皮放入10%氢氧化钠溶液并浸泡过夜或加热煮5min左右，待其溶液自然沉淀15min,取沉淀物镜检。或将上述沉淀物转入试管中，再加入60%硫代硫酸钠溶液，试管口加盖玻片，静置510min后，取盖玻片镜检。若镜检到蛾虫和/或蛾卵则判定为阳性。E.2血清学检测E.2.1方法采用间接酶联免疫吸附试验GELISA)检测待检血清样品中相应蜻虫的IgG抗体。E.2.2操作方法E. 2.2.1抗原制备E.2.2.1.1疥螭重组烯醇化酶蛋白(rSdr-Eno)的制备采用RT-PCR方法从兔源疥蛾cDNA文库中扩增疥螭Sm-Eno基因，将目的片段连接到pET32a(+)载体，并经公司测序核实序列
19、正确后转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，采用LOmMIPTG37诱导8h后，采用SDS-PAGE电泳验证表达情况(rSrEno约65kDa)o进一步将正确表达的菌株扩大培养和诱导表达，将菌液离心、超声破碎、锲柱纯化、透析及超滤后，获得纯化后的疥螭重组烯醉化酶蛋白(rS0六Eno),采用BCA试剂盒测定蛋白浓度后，分装保存于80备用。E.2.2.1.2绵羊痒蜻重组丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白GRoc27)的制备采用RT-PCR方法从绵羊痒螭cDNA文库中扩增Psoc27基因，将目的片段连接到pET32a(+)载体，并经公司测序核实序列正确后转化进大肠杆菌BL21(DE3)的感受态细胞，采用Lo
20、mMlPTG37C诱导8h后，采用SDS-PAGE电泳验证表达情况(Pyc27约75kDa)o进一步将正确表达的菌株扩大培养和诱导表达，将菌液离心、超声破碎、银柱纯化、透析及超滤后，获得纯化后的绵羊痒螭重组丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白CrPsoc27),采用BCA试剂盒测定蛋白浓度后，分装保存于-8(C备用。E.2.2.2抗原包被聚乙烯板用0.1M的碳酸盐缓冲液(PH9.6)将的抗原稀释到最佳浓度(rSar-Eno14.5gmL,rPsoc2746.0gmL)后加入聚乙烯板，每孔100L,4包被过夜。次日，弃孔内液体，每孔加入PBST缓冲液(0.0IMPBS+0.05%Tween-20,pH7.4)
21、300L,洗板3次，每次5min,拍干；E.2.2.3加封闭液每孔加5%脱脂奶粉(WV,5g脱脂奶粉+10OmLPBS)300L,37C封闭1.5h。弃孔内液体，洗涤同。E.2.2.4加待检血清每孔加入用PBS缓冲液(0.01MPBS,PH7.4)稀释的待检血清100L(rr-Eno=l:640；rPsoc27=1:100),每板同时设置标准阳性孔、标准阴性孔以及空白对照孔，分别加入标准阳性血清、标准阴性血清以及稀释液PBS作为对照。37C温育Ih后，弃孔内血清，洗涤同。E.2.2.5加酶标二抗用PBS缓冲液(0.01MPBS,PH7.4)将辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗稀释至工作浓度，力
22、口入100L,37C温育lh。弃孔内液体，洗涤同。E.2.2.6加底物显色每孔加入底物TMB(3,3,5,5,四甲基联苯胺)溶液100L,37C避光温育20minE.2.2.7终止反应每孔加入2M硫酸(H2SO4)50L终止反应，20min内用酶标仪测XX果。E.2.3结果判定以空白孔调零，用酶标仪测定450nm的吸光值(OD值)，若阳性对照OD值/阴性对照OD值的比例大于2.1,则实验结果成立。P为待检血清孔OD值，N为阴性对照孔OD值，以PN2.1判为阳性，PN2.1判为阴性。E.3分子生物学检查方法E.3.1方法采用聚合酶链式反应（PCR）技术，以线粒体CoXl基因为靶基因，对蛾虫特异性
23、DNA片段进行常规PCR检测。E.3.2操作方法E.3.2.1DNA的提取根据市售的微量基因组DNA提取试剂盒说明书分别提取附录痂皮和疥蛾虫体（事先在遇冷的研钵中加液氮研成粉末）的DNA,备用。E.3.2.2PCR扩增扩增总体积为25L,包括PCRMiXtUrel2.5L,待检样品DNA模板1.0L,上、下游引物各LOL（10pmolL,引物序歹J5GTGTGGAACTGGTAGAGG-3,5-CAGATCAAGCAAAAAGAGTTAAG-3O,灭菌蒸储水加至25.0L0同时设置疥螭DNA的阳性对照组和设置灭菌蒸储水的阴性对照组。扩增条件如下：94OC预变性3min：94OC变性30s,54
24、。C复性20s,72OC延伸20s,35个循环；72延伸8min；8储存Iomin。产物预期大小为212bp。E.3.2.3结果判定取6LPCR产物（包括待检样品、阳性对照、阴性对照）及5LDNA标准Marker,力口入L8%X脂糖凝胶板的孔内（含GOkiVieW核酸染料），经5Vcm电泳，电泳20min,于紫外凝胶成像仪或凝胶成像系统中观察结果。实验结果成立条件：XX性对照出现212bp扩增条带，空白对照未出现目的条带。在实验结果成立的情况下，待检样品出现预期大小（212bp）条带即为阳性（见图E.1）。M12图E.1PCR方法标准阳性扩增结果,注：M,DL2（XX）标准分子量（TakaRa
25、）;1,标准阳性扩增结果;2,阴性对照若需要进一步确认检测结果，可将电泳检测呈阳性的PCR剩余产物送公司进行测序，疥螭COXl基因参考序列（212bp）为：GtgtggaactggtagaggaactggctgaactatttatcctcctttatctagaatcacttatcattcAaatatgtctgtagattttacaattgtaagattacatattgctggaatttcttctattttaagttcTatcaattttattgtaactatttataatataaaaataaaaggaataagatgatcaaacttaactcTttttgcttgatctg参考文献11郝桂英，
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