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1、2023二代测序技术在胆管恶性狭窄诊疗中的应用【提要】胆管恶性狭窄的诊治是临床重大疑难问题，二代基因测序技术具有所需样本少、检测范围广、准确性高等优点，现本文就该技术在胆管恶性狭窄中的应用作一总结。【关健词】胆管肿瘤；胆管恶性狭窄；基因测序；二代测序；胰胆管造影术，内窥镜逆行胆管狭窄病因包括良性和恶性两大类，良性狭窄有原发性硬化性胆管炎、慢性胰腺炎、胆石症及胆管损伤等，恶性狭窄包括肝、胆、胰系统恶性肿瘤及其他转移瘤，其中以胆管癌、胰腺癌最为常见。胆胰恶性肿瘤起病隐匿，黄疸等症状常常是患者就诊的直接原因，当出现临床症状时多数已属肿瘤晚期，手术切除率低，常规放化疗效果不佳，总体预后极差。早期明确胆
2、管狭窄的性质至关重要，血清肿瘤标志物CA19-9,虽然在诊断胆管恶性狭窄的敏感度达80%左右，但假阳性率较高。内镜逆行胰胆管造影术（ERCP）常常是较早介入的诊疗手段，除可以进行胆管造影外，还可获取脱落细胞或组织活检样品，用于病理诊断。然而，传统病理学诊断阳性率较低，仅30%左右，致使多数临床患者不能及时确诊，延误治疗时机。随着基因检测技术的日新月异，二代测序技术以其高通量、耗时短的特点，被广泛用于恶性肿瘤的精准诊断和治疗。近年来，胆胰肿瘤中的突变基因逐渐被发现，对其中高频突变基因的检测成为辅助诊断性质不明胆管狭窄的新手段，该方法所需样品少，精度高，且检测结果能为后续靶向治疗提供指导。本文拟对
3、胆胰肿瘤常见的突变基因和重要的治疗靶点进行回顾，并就二代测序技术在胆管狭窄诊疗中的现状及应用前景作初步探讨。一、胆胰系统肿痛基因突变情况概览胆管恶性狭窄的常见病因包括胆管癌、胰腺癌、胆囊癌及壶腹癌。根据解剖部位，胆管癌可分为肝内胆管癌和肝外胆管癌，二者间的发病机制、肿瘤微环境及分子分型等均有很大差异。Nakamura等对260例胆管癌和胆囊癌样品进行基因组检测，发现约40%的病例存在可靶向的基因突变，其中突变频率最高的5个基因为TP53(26%)、KRAS(18%)、ARID1A(11%)、SMAD4(9%)及BAP1(8%)oTP53、BRCA1、BRCA2及PI3KCA突变在肝内胆管癌、肝
4、外胆管癌及胆囊癌中均有发现，而FGFR2基因融合突变及IDH1/2突变主要发生在肝内胆管癌中，PRKACA和PRKACB基因融合突变则特征性地出现在肝外胆管癌中。另有研究证实，存在TP53和KRAS突变的胆管肿瘤患者预后较差，而FGFR2的融合突变则一定程度上改善了预后；在该项研究中，对412例肝内胆管癌、57例肝外胆管癌及85例胆囊癌样品进行基因测序,在肝内胆管癌中,TP53(27%)、CDKN2A/B(27%)、KRAS(22%)、ARID1A(18%)和IDH1(16%)突变最为常见；肝外胆管癌最高频率突变基因则分别为KRAS(42%)、TP53(40%)、CDKN2AB(17%)和SM
5、AD4(21%);而胆囊癌则是CDKN2A/B(19%)、ARIDIA(13%)和ERBB2(16%)。胰腺癌压迫或侵犯胆管是下段胆管狭窄的常见病因之一，其具有很高的异质性，2008年Jones等首次对24例胰腺癌患者样品进行了全基因组的检测，发现每例患者平均存在63个基因突变，其中大部分为点突变，高频突变基因包括KRAS、CDKN2AsTP53和SMAD4等。2012年Biani(W-I1.6%0%-0.7%0%-l.9%(M*-O.64*1%-5.3*APC0-1.4(Wfr-73%OI3.9%-5%223%“8/3.5%ERBB2l.l%3%O%ll%O.WI%4.4%l69fr3.8%
6、-9*2%8.8%ATMo%y.%6%-IO%2.7*7%5%I33%7%IO.ft%1%PBKCA4.2%T*0%7%029.6%I4%II%I3.I%4%88*BAPI8%-19%O%-I2%0%-l%0%-2O%I52i-63J%注:TP53指料麻微门53:M44u/mL)对诊断恶性狭窄的敏感度分别为48%和76%,特异度分别为99%和69%；二代测序技术诊断恶性狭窄的敏感度和特异度为73%和100%二代测序技术与病理检查相结合,可将诊断敏感度提高至83%。该研究还纳入37例有原发性硬化性胆管炎病史的患者，其中12例患者在此基础上发生了恶变，在该类人群中，二代测序技术和病理检查的诊断特异
7、度均为100%,但病理的敏感度仅为8%,而二代测序技术的敏感度则达到83%值得注意的是，约13%的恶性肿瘤患者通过二代测序技术发现了治疗相关的基因改变，其中2例ERBB4拷贝数异常的患者在后续治疗中采用常规化疗(吉西他滨和顺钳)联合曲妥珠单抗的治疗方案，取得较好疗效。这一研究凸显了二代测序技术在胆管良恶性狭窄诊疗方面的适用性和有效性。荧光原位杂交技术同样被用于胆管良恶性狭窄的鉴别，有良好的特异度，但敏感度较低，且费用和技术难度较高。Dudley等利用81例胆管刷检样品将荧光原位杂交技术和二代测序技术的诊断效能进行对比，在该研究中，细胞形态学检测的敏感度、特异度和准确率分别为67%、98%和85
8、%;荧光原位杂交技术检测的敏感度、特异度和准确率分别为55%、94%和78%;而二代测序技术检测的敏感度、特异度、准确率分别为74%、98%和88%o研究者将二代测序技术或荧光原位杂交技术检测与细胞学检测联用，发现二代测序技术联合细胞学检测的敏感度提高至85%,特异度略微下降至96%,准确率达到91%;而荧光原位杂交技术检测与细胞学检测联合并不能进一步提高诊断效能，其敏感度为76%,特异度为92%,准确率为85%该研究表明相比于荧光原位杂交技术，二代测序技术的诊断效能更好，并可以与细胞形态学检测互为补充。有趣的是,Harbhajanka等在近期一项研究中采用胆管细胞刷检样品离心后的上清液进行二
9、代测序技术检测，这些样品一般在病理检测中会被丢弃。该项研究共检测55个基因，其中KRAS和TP53突变频率最高，分别为77%和49%在94例胆管狭窄患者中，二代测序技术诊断胆管恶性狭窄的敏感度和特异度分别为93%和100%;而同时进行病理检测的敏感度和特异度分别为49%和100%在细胞形态学报告为异型的18例患者中，有15例最终诊断为恶性，其中14例二代测序技术检测阳性，体现出二代测序技术检测的优越性。采用细胞刷检样品离心后的上清液用于二代测序技术检测并不影响常规细胞学评估，也不需要额外取材，为后续研究提供了良好思路，具有较佳的临床应用前景。除对通过ERCP获得的细胞及组织样品进行检测外，尚有
10、部分研究将胆汁样品的液体活检用于鉴别胆管狭窄性质。液体活检作为一项新兴的体外诊断技术，与传统组织活检的一致性良好，而由于毗邻肿瘤组织，胆汁中相比于血清含有更为丰富的游离DNA,而胆汁在ERCP操作中是较为容易获取的样本。Driescher等在29例有配对胆汁和肿瘤组织样品的患者中，发现液体活检与组织活检的二代测序技术检测-致性可达96.2%,而血浆液体活检的一致性仅为31.6%,提示胆汁相比于血浆更适合于液体活检。Arechederra等近期发表一项研究，证实胆汁中的游离DNA含量约为血浆中的20倍，且含有DNA片段较长，利用二代测序技术检测胆汁游离DNA中的52个基因，在68例不明原因胆管狭
11、窄患者中，其诊断恶性狭窄的敏感度和特异度分别为96.4%和69.2%而同时进行病理检测的敏感度和特异度分别为60%和100%,病理诊断35例患者为良性或不确定，其中22例最终诊断为恶性，这些患者胆汁游离DNA的二代测序技术检测均为阳性，敏感度达IO0%。从上述研究可以看出，相比于细胞刷检样本，液体活检样本用于二代测序技术对胆管恶性狭窄的诊断敏感度较高，但特异度相对较低。推测其原因，可能是由于胆汁中含有来源于整个胆管不同部位的基因信息，突变基因检出率较高；而细胞刷检往往仅局限于狭窄部位和样品含量，导致检测敏感度不高。在特异度方面，液体活检存在约30%的假阳性率，一些炎症诱导的细胞损伤或癌前病变可
12、能导致假阳性结果。而令人惊奇的是，Arechederra等报道的4例液体活检误报为假阳性的患者（临床最终诊断为良性狭窄），其中1例患者在10个月后确诊胰腺癌。早期一项研究评估原发性硬化性胆管炎患者胆汁中存在的游离细胞可能存在KRAS突变，在随访中，只有那些存在KRAS突变的个体发生了胆管癌或高级别上皮内瘤变。这表明胆汁液体活检除对现有病变有鉴别作用外，可能对未来肿瘤发生风险有一定的预测作用。三、展望目前胆管恶性狭窄的早期定性诊断仍存在困难，二代测序可以作为临床病理检查的重要补充，在保持较高诊断特异度的情况下，提高诊断敏感度，对尽早确定患者病变性质具有重要意义。近些年来，胆管恶性肿瘤的靶向治疗方兴未艾，针对诸如FGFR2融合突变、IDHI/2突变以及ERBB2异常扩增等基因改变，均可以应用相应的靶向药物进行有效治疗。因而二代测序不仅可以作为诊断工具，也可以及时发掘潜在的治疗靶点，指导精准治疗。目前，国内二代测序技术在诊断胆管肿瘤方面的应用较少，价格相对昂贵，缺乏统一标准，急需开展大规模临床研究验证其应用价值，并探寻合适的测序范围和测序深度，研究国人胆管肿瘤的基因谱，提高此类患者的临床诊疗水平。
