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1、建立一种宏基因组二代测序DNA流程检测BALF标本的性能确认方法摘要目的建立一种宏基因组二代测序（mNGS）DNA流程检测BALF标本的性能确认方法。方法以Hela细胞代表宿主细胞，向无菌生理盐水中加入不同浓度Hela细胞、7种病原体（肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌、白色念珠菌、新型隐球菌、烟曲霉和腺病毒）和干扰物质制备模拟BALF标本，同时收集临床BALF标本,以传统检测方法为参比方法，评价mNGS检测结果，确定mNGS的最低检出限、精密度、抗干扰能力、稳定性和准确度。结果模拟标本中，肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌、白色念珠菌、新型隐球菌、烟曲霉和腺病毒7种病原体的最低检出限
2、分别为150、262、102、67、96、83CFU/ml和439拷贝/ml。模拟阳性标本中所有病原体重复检测结果符合率均为100%o抗干扰试验结果显示，人源核酸浓度越高，mNGS检出病原体序列数越少。以大肠埃希菌和宋内志贺菌评价mNGS对近源物种分辨能力，结果显示，当宋内志贺菌浓度为4000CFU/ml时，该系统能稳定分辨大肠埃希菌和宋内志贺菌。稳定性试验结果显示，标本进行1、2、3次冻融或在4回、-20日、-80回放置36h后病原体序列数无明显变化。与传统检测方法相比，17份临床标本的初步准确度为82.4%(14/17)o2021年10月25日至2022年9月14日同济医院同时进行mNGS
3、和传统方法检测的临床BALF标本的持续评估结果显示，mNGS相对细菌培养、真菌培养、分枝杆菌培养、结核分枝杆菌培养和常规PCR技术的准确度分别为67.5%(472/699)、81.5%(570/699)92.3%(335/363)、96.4%(350/363)和86.8%(132/152)。与常规PCR技术比较，mNGS检测耶氏肺抱子菌、腺病毒、肺炎支原体的准确度分另I为89.4%(8494)、93.3%(56/60)和87.1%(61/70)o结论通过制备模拟BALF标本以及以传统检测方法为参比方法，可以初步评价mNGS检测BALF标本的性能特征。呼吸道感染因其发病率和病死率高，成为全球主要
4、的健康问题，下呼吸道感染尤为严重。下呼吸道感染病原谱广,及时获得病原学诊断，对于针对性治疗和预防具有至关重要的作用。宏基因组二代测序(metagenomicnext-generationsequencing,mNGS,又称高通量测序或下一代测序技术)因其无靶向检测病原体特点，在疑难感染病例诊断、少见病原体和新发病原体感染防治中发挥了重要作用，受到普遍关注1,2,3,4o然而，mNGS如此广泛的病原谱，加之操作的复杂性，使其性能确认难以实施，文献报道有限5。支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolarlavagefluid,BALF）是下呼吸道感染疑难病例、少见和新发感染病例病原学诊断的重要
5、标本，相较于血液、脑脊液等无菌标本，BALF病原学更为复杂，本研究借鉴近年国外一些实验室完成的脑脊液及其他体液标本的mNGS性能评估方案6,7,8,参考相关专家共识1,9,10,11,结合mNGS无靶向检测病原体特点，基于mNGSDNA流程检测BALF标本，建立初步性能评估和持续性能评估相结合的方法，探索逐步完善mNGS技术性能确认的方案。材料与方法一、材料（一）模拟阴性BALF标本以Hela细胞（人宫颈癌细胞）代表宿主细胞，将购自武汉普诺赛生命科技有限公司的高浓度Hela细胞1600Xg离心5min,倍比稀释后采用血球计数板计数。以含有2X105个/mlHela细胞的无菌生理盐水模拟阴性BA
6、LF标本。（二）模拟阳性BALF标本1.复苏菌株：将保存的肺炎克雷伯菌、白色念珠菌和新型隐球菌纯菌株接种于血平板，将肺炎链球菌、流感嗜血杆菌接种于巧克力平板，将烟曲霉接种于沙保罗斜面培养基，置于37C恒温箱中培养过夜（巧克力平板培养需维持5%C02环境）。2.配制菌悬液：复苏后的细菌和真菌经质谱鉴定正确后,用灭菌木棒挑取血平板和巧克力平板上的单个菌落，溶于无菌生理盐水，充分混匀，配制麦氏比浊度为05的菌悬液；向沙保罗斜面培养基中加入适量无菌生理盐水，轻柔颠倒混匀，将液体转移至比浊管，调整无菌生理盐水体积以配制0.5麦氏比浊度的烟曲霉菌悬液。3.制备阳性BALF标本：采用平板菌落计数法对倍比稀释
7、后的菌悬液进行定量。病毒拷贝数则通过实时荧光定量聚合酶链式反应计算。根据研究设计的终浓度于模拟阴性BALF标本中加标不同病原体以模拟阳性BALF标本。以上模拟标本一次性配制，-20。C保存。（三）临床BALF标本将17份于华中科技大学同济医学院附属同济医院进行传统方法检测的临床BALF标本（14份阳性，3份阴性）用于mNGS的初步准确度确认。将2021年10月25日至2022年9月14日于该院同时进行mNGS和传统方法检测BALF标本的病例纳入本研究用于持续准确度评估。二、仪器和试剂1.仪器：REF21250DensiCHEK电子比浊仪VlTEK（法国梅里埃公司）、BioPreP-24生物样品
8、均质仪（北京天根公司）、QSePl生物片段分析仪（台湾光鼎公司）、QUbit4.0核酸荧光定量仪（美国ThermoFisherScientific公司）NextSeqCN500高通量测序仪（美国Hlumina公司）、全自动微生物质谱检测系统Autofmsl000（郑州安图生物公司）。2.试剂：DNA提取试剂盒（粤穗械备20191662号，广州微远医疗器械有限公司）、基因组DNA片段化试剂盒（粤穗械备20202085号,广州微远医疗器械有限公司）、QubitdsDNAHSAssaykit试齐IJ盒（美国ThermoFisherScientific公司）、NeXtSeqCN500高通量测序试剂盒（
9、美国illumina公司）。三、检测方法1传统检测方法：微生物分离培养包括细菌、真菌和分枝杆菌。除非结核分枝杆菌（non-tuberculousmycobacteria,NTM）通过16SrDNA测序外，其他病原体采用质谱鉴定、PCR技术如常规PCR技术检测BALF标本中耶氏肺抱子菌、咽拭子中腺病毒和肺炎支原体，以及GeneXPertMTB/RlF技术检测结核分枝杆菌（MyCObaCteriUmtuberculosis,MTB）/利福平耐药。2.mNGS：对600IBALF标本进行破壁处理，取300I破壁后标本进行核酸提取、建库和加标签。对纯化、扩增、再纯化后的文库进行片段大小和浓度测定，将合
10、格文库加载至测序仪上进行75个循环单端测序，每个文库生成约2000万序列。测序数据下机后通过Trimmomatic软件去除低质量、长度小于40bp的序列和接头序列以获得高质量的数据。mNGS检测系统从美国国家生物技术信息中心(NatiOrIalCenterforBiotechnologyInformation,NCBI,https：/www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的RefSeq(https：/www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/)和nt/nr(https：/www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/)数据库中筛选人类相关序列，选用人类参
11、考基因组hg38和中国人群的两个参考基因组YH2.0和HXl作为宿主参考基因组构建人源数据库(IDhostV2.0),从病理系统资源整合中心(PAThOSVStemSResourceIntegrationCenter,PATRIC,https：/www.patricbrc.org/)全球共享禽流感数据倡议组织数据库(GlobalInitiativeonSharingAvianInfluenzaData,GISAID,https：/www.gisaid.org/)、GenBank数据库(https：/www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)、NCBI的RefSeq和nt/nr
12、数据库中筛选微生物参考基因组，构建微生物数据库(IDseqDBV2.0：包含12142种细菌、2680种真菌、206种分枝杆菌、10061种病毒、654种寄生虫和120种支原体/衣原体)。通过BUiTOWS-WheeIerAligner软件(BWA：http：bio-特异性序列、鉴定置信度、相对丰度等信息。四、性能确认参数（一）检出限选择7种病原体（肺炎链球菌代表革兰阳性细菌、流感嗜血杆菌和肺炎克雷伯菌代表革兰阴性细菌、白色念珠菌和新型隐球菌代表酵母菌、烟曲霉代表霉菌、腺病毒代表DNA病毒）建立不同物种的检出限。根据文献和预试验结果预估各病原体检出限，并在此浓度附近配制4个浓度梯度工作液（在模
13、拟阴性BALF标本中加标不同浓度的代表性病原体制备模拟阳性标本），每个浓度至少重复检测10次。利用SPSS22.0（美国IBM公司）软件进行PrObit统计学分析，病原体95%检测阳性率时的最低浓度即为检出限。（二）精密度在模拟阴性BALF标本中加入3倍检出限（模拟弱阳性标本）的肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌、白色念珠菌、新型隐球菌和烟曲霉，加入1倍检出限（模拟临界阳性标本）的腺病毒得到模拟阳性BALF标本。每天重复10次检测该标本，连续检测2d。（三）抗干扰能力1.人源核酸干扰：根据精密度试验方案加入7种病原体,将模拟BALF标本中人源核酸浓度调整为2X105、21062X107个/
14、mlHela细胞，比较不同浓度人源核酸对检测结果的影响。2.近源物种干扰：将大肠埃希菌和宋内志贺菌按照3种不同比例混合后加入模拟的阴性BALF标本中（大肠埃希菌和宋内志贺菌的浓度分别为IoOo：1000菌落形成单位（colonyformingunits,CFU）/ml、4000：IoooCFU/ml和1000：4000CFUml）,以验证mNGS检测系统分辨近源物种的能力。（四）稳定性分别对精密度试验中制备的模拟阳性BALF标本进行1、2、3次冻融，评估冻融次数对检测结果的影响。将模拟的阳性BALF标本分别放置在4、-20、-8036h,评估保存温度对检测结果的影响。（五）准确度将同时接受BA
15、LFmNGS和传统方法检测，且检测时间相距5d以内的病例纳入mNGS准确度评估，以传统检测方法作为参考方法来评估mNGS准确度。同一病例中，mNGS未检测到传统方法所检出的任一病原体则被定义为mNGS假阴性,传统方法检测阴性，而mNGS检测阳性则被定义为mNGS假阳性。结果一、检出限通过Probit分析，确定了模拟标本中7种病原体的检出限，结果见表1。其中，细菌类病原体的检出限(平均171CFUml)高于真菌类病原体的检出限(平均82CFU/ml)。表1mNGS检测模拟BALF标本中7种病原体的检出限和精密度，,1病原体检出限精密度(重复检测结果符合率%)肺炎链球菌150(CFUml)流感嗜血
16、杆菌262(CFUml)肺炎克雷伯菌102(CFU/ml)白色念珠菌67(CFUml)新型隐球菌96(CFUZml)烟曲霉83(CFUml)腺病毒439(拷贝/ml)100100100100100100100注：mNCS为宏基因组二代测序，BALF为支气管肺泡灌洗液,CFU为菌落形成单位二、精密度模拟阳性BALF标本中各病原体重复检测结果符合率均为Io0%,见表1。三、抗干扰能力本研究结果显示随着模拟标本中人源核酸水平的升高，mNGS检出病原体的序列数降低，当人源核酸水平达到2X107个/mlHela细胞时，7种病原体均未检出(图1)。近源物种大肠埃希菌和宋内志贺菌的浓度为IOoo:4000C
17、Fml时,检出序列数分别为19和18条;2种细菌浓度分别为1000：1OOO或4OOO：1000CFU/ml时，均仅检出大肠埃希菌,序列数分别为37和84条。(课)辍试也S及睡螺S9NE肺炎链球菌流感嗜血杆菌-肺炎克雷伯菌三白色念珠菌新型隐球菌烟曲霉腺病毒图1包含不同浓度人源核酸的模拟标本的宏基因组二代测序检测结果四、稳定性标本冻融次数和保存温度对mNGS检测系统的影响见图2。模拟的阳性BALF标本进行1、2、3次冻融或在4、-20-80放置36h后检测到的病原体序列数无明显变化。(盛)摄武仕S及殴怪田姿仕W茎11三困潮泉Ooooo5O5O5O7272722112211标本冻融（次）3-肺炎链
18、球菌一流感嗜血杆菌一肺炎克雷伯菌一白色念珠菌-新型隐球菌一烟曲霉腺病毒(胤)赧定仕S拄畋三罂仕氯YN姒困潮於Oooooo5O5O38383211211标本保存温度（C）一肺炎链球菌流感嗜血杆菌-肺炎克雷伯菌一白色念珠菌-新型隐球菌一烟曲霉腺病毒图2稳定性评估结果（2A为不同冻融次数时模拟标本的宏基因组二代测序检测结果；2B为不同温度保存条件下模拟标本的宏基因组二代测序检测结果)五、准确度用于初步准确度评估的17份临床BALF标本(热带念珠菌和肺炎克雷伯菌阳性标本各3份，近平滑念珠菌、鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌阳性标本各2份，结核分枝杆菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌、黏质沙雷菌、洋
19、葱伯克霍尔德菌、光滑假丝酵母菌、烟曲霉和长苑洛德酵母菌阳性标本各1份)中，2份临床阳性标本(分别培养出近平滑念珠菌和光滑假丝酵母菌)经mNGS检测为阴性，1份培养阴性的临床标本经mNGS检出流感嗜血杆菌，mNGS检测系统的敏感度和特异度分别为85.7%(12/14)和66.7%(2/3),准确度为82.4%(14/17)。临床BALF标本持续评估阶段，mNGS相对传统检测方法的准确度评估结果见表2o共纳入699份细菌培养病例，mNGS对细菌检测的敏感度、特异度和准确度分别为84.3%(118/140)、63.3%(354/559)、67.5%(472/699)。mNGS检测假阳性的205份标本
20、中，肺炎链球菌、流感嗜血杆菌和肺炎克雷伯菌的检出率分别为16.6%(34/205)、22.0%(45/205)和13.2%(27/205)。mNGS诊断真菌感染(699份)的敏感度、特异度和准确度分别为81.6%(133/163)、81.5%(437/536)和81.5%(570/699)。99份假阳性标本中,白色念珠菌和烟曲霉的占比分别为39.4%(39/99)和20.2%(20/99)0在30份mNGS假阴性真菌标本中，近平滑念珠菌最常见，占所有近平滑念珠菌培养阳性标本的91.7%(11/12)o表2宏基因组二代测序相对传统检测方法的准确度评估结果宏基因组二代测序真阳性假阳性假阴性真阴性相
21、对传统检测方法(份)(份)(份)(份)细菌培养11820522354真菌培养1339930437分枝杆菌培养20226315结核分枝杆菌培养1894332常规PCR技术291010103以分枝杆菌培养作为参比方法,在363份BALF标本中，mNGS检测分枝杆菌的敏感度、特异度和准确度分别为76.9%(20/26)、93.5%(315/337)、92.3%(335/363)。其中，mNGS检测NTM真阳性、假阳性、假阴性、真阴性标本分别为2、13、2和346份，敏感度、特异度和准确度分别为50.0%(2/4)、96.4%(346/359)和95.9%(348/363)。mNGS检测MTB真阳性、
22、假阳性、假阴性、真阴性标本分别为18、9、4和332份,敏感度、特异度和准确度分别为81.8%(18/22)、97.4%(332/341)和96.4%(350/363)。mNGS检测MTB假阴性的4份标本均接受了培养和GeneXpertMTB/RIF检测，其中两种方法均检出MTB的标本有2份，仅通过培养检出MTB的标本有2份。同样，以分枝杆菌培养作为参比方法，在318份BALF标本中，GeneXpertMTB/RIF检测MTB真阳性、假阳性、假阴性、真阴性标本分别为17、4、5和292份，敏感度、特异度和准确度分别为77.3%(17/22)、98.6%(292/296)和97.2%(309/3
23、18)。mNGS相对常规PCR技术(152份标本检测病原体包括耶氏肺抱子菌、腺病毒和肺炎支原体)的敏感度、特异度和准确度分别为74.4%(29/39)、91.2%(103/113)、86.8%(132/152)。mNGS检测耶氏肺抱子菌(94份)的敏感度、特异度和准确度分别为8/14、95.0%(76/80)和89.4%(84/94)omNGS检测腺病毒(60份)的敏感度、特异度和准确度分别为3/5、96.4%(53/55)、93.3%(56/60)。70份进行肺炎支原体检测的临床BALF标本中，mNGS的敏感度、特异度和准确度分别为86.4%(19/22)、87.5%(42/48)和87.1
24、%(61/70)。止匕外，我们对传统方法难以检测的病原体的mNGS检出情况进行了统计，结果显示在762份BALF标本中，mNGS额外检出25份惠普尔养障体、15份新型隐球菌、8份鹦鹉热衣原体、2份口腔毛滴虫、2份刺变形虫副衣原体、1份圣乔治诺卡菌和1份沙眼衣原体。讨论近年来，mNGS在临床研究，特别是在少见、疑难感染病例中应用的报道逐渐增多，显示出良好的应用前景。然而,该技术的无靶向检测特征，使其性能确认面临极大挑战。本实验室基于mNGSDNA流程检测BALF标本，通过制备模拟标本辅以临床标本，建立初步性能评估和持续性能评估相结合的方法，探索mNGS的性能确认方案。本研究制备的模拟BALF标本
25、中各病原体的mNGS检出限存在差异，总体而言，细菌检出限高于真菌，该结果与MilIer等6,7的研究结果基本一致，可能与不同类型病原体基因组大小存在差异等因素有关。mNGS检测的干扰因素除人类宿主核酸外，还应考虑邻近物种间的交叉反应12。鉴于埃希菌属与志贺菌属具有较高的基因组相似性(70%),本研究通过制备大肠埃希菌和宋内志贺菌混合感染标本，评估mNGS对近源物种的分辨能力，结果显示，当两种菌同为低浓度(1000：1000CFml),或仅宋内志贺菌为低浓度时，mNGS出现宋内志贺菌假阴性结果，而大肠埃希菌不受浓度影响，在本研究设计的三组混合浓度标本中均能检出，这可能与大肠埃希菌特异性区域长于志
26、贺菌属，在混合菌中更容易被检出有关。随着临床应用的进展，定期分析检测结果可以作为mNGS初始性能确认的重要附加内容，用于逐步完善准确性评估和优化检测系统13。我们的研究结果也表明，持续性能确认可以弥补初步确认试验中标本量不足，病原体覆盖少，以及传统检测方法缺乏分层分析等缺点，因此，持续性能确认结果更准确和全面，是初步性能确认试验必要的补充。本研究准确度的持续评估结果显示mNGS相对细菌和真菌培养特异度小于90%，有以下几种可能原因：（1）微生物培养受方法学限制，检测病原谱窄，其检测灵敏度可能较mNGS低，此时的mNGS假阳性结果实际上可能为真阳性；（2）相对于微生物培养需要活的微生物，mNGS
27、不易受抗菌药物治疗的影响，对活的和死的微生物核酸均可检出，具有更高的阳性检出潜能。此外，mNGS测序读长较短（特异性较低），测序过程可出现碱基读取错误，比对数据库不精密，生信分析方法缺陷，以及实验过程可引入微生物或核酸污染等均可能导致mNGS检测假阳性，因此对于mNGS检测的阳性结果，尤其是少见病原体的检出通常需要其他方法学验证。本研究结果也表明mNGS检测的敏感度较低（70%90%）,除了可能与mNGS测序深度不足、病原体与宿主基因占比低、标本未充分破壁等多种因素有关外10,还可能与本研究仅以单一传统检测方法作为参考方法有关。值得注意的是,我们发现近平滑念珠菌在mNGS检测中具有较高的漏检率
28、，查阅原始数据发现一部分标本检出近平滑念珠菌，但归为微生态，另一部分标本检出序列数太低，表明mNGS检出近平滑念珠菌的临床价值及报告规则还需进一步评估。核酸提取效率是影响mNGS结果的重要因素，MTB相较其他微生物更难提取核酸，且易形成菌团，难以制备模拟标本。因此，本研究采用持续评估的方式对mNGS检测MTB的性能进行确认，可充分反映mNGS检测系统的核酸提取效率和对MTB的检测性能。结果显示mNGS对MTB、细菌和真菌具有相似的诊断敏感度（分别为81.8%、843%和81.6%）,说明mNGS具有良好的破壁效果以及核酸提取效率。关于mNGS和GeneXpertMTB/RIF对MTB诊断效能的
29、比较尚无统一的结论14,15o本研究结果显示，mNGS诊断MTB的敏感度略高于GeneXPertMTB/RIF（81.8%比77.3%）,特异度与GeneXPertMTB/RIF相似（97.4%比98.6%）。上述结论不一致的原因可能与不同研究采用的检测技术平台、研究人群以及参考标准不同等有关。综上所述，mNGS对BALF中的MTB具有良好的检测性能。值得注意的是，本研究中，mNGS检测NTM的敏感度为50.0%,这可能与阳性标本量太低（4份临床阳性标本）有关，还需扩大样本量进一步评估。本研究局限性如下：（1）本研究中模拟病原体种类及标本量较少，后续需增加病原体种类及数量，对其检出限、精密度等
30、指标进行性能确认。（2）mNGS检测无靶向，随着mNGS进一步开展，新的病原体将不断出现，因此需要开展持续性能确认。（3）临床实践尚缺乏RNA病毒、寄生虫及其他标本类型等的性能确认数据，后续需要补充其他标本和微生物类型以完善mNGS的性能确认。综上所述，本研究结果表明对于传统检测手段无法确定病原体的疑难病例以及危急重患者可进行mNGS检测，而对于有明确怀疑病原体的感染病例则首选传统方法检测。同时,本研究通过制备模拟BALF标本以及收集小样本量临床标本，以传统检测方法为参比方法，初步确认了mNGS检测BALF标本的性能特征，在项目开展后，扩大样本量对其准确度进行持续性能评估，为本机构提高mNGS检测质量和能力提供了科学依据，也为其他实验室及相关技术的性能确认提供了思路。
